【摘要】 目的 研究p27mt基因对大肠癌裸鼠移植瘤的生长抑制和抗转移作用及其机制。方法 建立大肠癌裸鼠移植瘤模型，采用瘤体内直接注射法，测量瘤体体积，观察p27mt对移植瘤的生长抑制作用。分离瘤体，制作单细胞悬液，流式细胞术检测细胞周期，测定细胞凋亡。免疫组化检测瘤体组织中mmp9的表达。结果 adp27mt组、adlacz组和对照组移植瘤平均体积分别为（1.94±0.67）cm3、（2.75±0.83）cm3和（3.01±0.76）cm3（p<0.05）；增殖率分别为（37.34±1.45）％、（53.16±3.27）％和（54.48±2.43）％（p<0.05）；凋亡率分别为（19.79±3.32）％，（6.38±4.91）％和（7.25±5.20）％（p<0.01）；mmp9的表达率为20％、75%和66.7％（p<0.01）。结论 人突变p27mt基因通过阻滞移植瘤的增殖, 促进移植瘤细胞的凋亡来抑制移植瘤的生长，通过降低移植瘤mmp9的表达抑制移植瘤的转移。
【关键词】 大肠癌 p27mt基因 裸鼠 mmp9
随着人们生活水平的提高，饮食结构的改变，结肠癌发病率在逐渐上升[1]。结肠癌的治疗包括手术、放疗、化疗，但效果均不理想。随着后基因时代的到来，基因的功能成为人们研究的重点，为肿瘤的基因治疗带来了曙光。WWw.11665.comp27基因是一种抑癌基因，本研究旨在通过动物实验来探讨突变型p27基因对大肠癌的生长及转移方面的作用机制，为p27治疗大肠癌提供依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株及腺病毒
lovo细胞购于武汉大学标准物保藏中心，用rpmi1640培养基培养，调整细胞浓度至1×108/ml,台盼蓝染色活细胞计数>99%。adlacz由王家宁博士等构建并惠赠[2]。adp27mt由本人构建[3]。
1.2 结肠癌裸鼠移植瘤模型的建立及分组 购买balb/c裸鼠36只（湖北省实验动物管表1 各组移植瘤细胞周期分布，pi及凋亡率*：adp27mt group comparisons with control group and adp27mt group,p<0.01理中心），鼠龄4～ 6周,体重18～ 25g。取0.2ml结肠癌lovo细胞悬液，分别在裸鼠右侧背部皮下接种，共36只。成瘤后选用肿瘤大小介于0.5～ 1.5cm之间的裸鼠27只，随机分为对照组，adlacz组和adp27mt组。采用瘤体内直接注射法,每次分别注射pbs 0.1ml, adlacz0.1ml (病毒含量1010pfu/ml)和adp27mt 0.1ml(病毒含量1010pfu/ml)。3日1次，连续28天。
1.3 移植瘤体积测定
测定移植瘤的长径（a）和短径（b），按公式v=a2b/2计算体积。
1.4 流式细胞术
待裸鼠移植瘤模型治疗28d后，处死裸鼠，分离瘤体、称重、照相。分别切取移植瘤组织15g，制成单细胞悬液，取100μl，加入dnapreptmlpr 200μl混匀，室温避光3min后加入dnaprepstain 1 000μl染色试剂混匀，15min后在coulter epics xl流式细胞仪上检测细胞周期及细胞凋亡。细胞增殖指数（pi）按以下公式计算：
pi=s+g2/mg0/g1+s+g2/m×100%
1.5 免疫组化检测mmp9的表达
sp法染色鼠抗人mmp9单克隆抗体，sp试剂盒，dab显色剂购自北京中山公司，具体步骤按试剂盒说明书进行。结果判断标准：mmp9为胞质中的棕黄色颗粒。在癌巢周边基质区，计数5个视野，每个视野计数细胞总数及mmp9表达阳性的癌细胞数，根据细胞着色的范围及程度，将免疫组织化学程度分为:-未见阳性染色细胞；+着色淡或着色细胞<10%；++着色适中或着色细胞占10%～ 25%；+++着色深或着色细胞大于50%。-为阴性表达；+/++为弱阳性表达；+++为强阳性表达。
1.6 统计学方法
计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验，计数资料用χ2检验。
2 结果
2.1 各组移植瘤末次体积比较
adp27mt组移植瘤平均体积（1.94±0.67）cm3显著小于对照组移植瘤平均体积（3.01±0.76）cm3（p<0.05）；对照组移植瘤平均体积（3.01±0.76）cm3与adlacz组移植瘤平均体积（2.75±0.83）cm3相比较，差异无统计学意义(p>0.05)，见图1。
图1 移植瘤体积的比较（cm3）
fig 1 comparison of volum among groups in
transplanted colorectal carcinoma（cm3）
2.2 各组移植瘤细胞周期分布、pi及凋亡率比较
adp27mt组移植瘤g0/g1期细胞增多，s期及g2/m期细胞减少，adp27mt组与其他组比较差异有统计学意义（p<0.05），对照组与adlacz组比较差异无统计学意义（p>0.05），见表1。
2.3 mmp9在移植瘤中的表达
mmp9主要在癌巢周边基质区域，着色于癌细胞的胞浆中，呈棕黄色颗粒，见图2。adp27mt组中mmp9的表达比对照组明显降低，见表2。
a：control group; b：adp27mt group
图2 mmp9在移植瘤中的表达
fig 2 expression of mmp9 in
transplanted colorectal carcinoma
3 讨论
p27是一种细胞周期负调控因子，是一种抑癌基因[4]。其表达异常（缺失或减少）时，细胞周期的 # p>0.05: adlacz group vs control group；* p<0.05: adp27mt group vs adlacz group and control group抑制作用减弱，将导致细胞生长的失控，发生癌变[5]。ganoth等[6]和troncone等[7]研究结果表明：p27表达降低与泛素介导的蛋白酶体磷酸化p27/187位点的苏氨酸降解途径作用异常增强有关。因此，本课题通过瘤体内直接注射187位突变的p27mt基因重组腺病毒，研究其在体（in vivo）对移植瘤的抑制作用。
park等[8]发现p27mt(mutant type p27)对肿瘤细胞的抑制作用比p27wt(wild type p27)作用更强，使细胞阻滞于g0/g1期，且有更强的促细胞凋亡作用。jaen等[9]进一步研究发现p27mt的半衰期超过12h，远超过野生型p27wt的2h。本课题通过测定移植瘤体积，发现p27mt基因对大肠癌的生长有明显的抑制作用，其机制可能是通过抑制细胞的增殖和促细胞凋亡作用。通过细胞增殖指数的测定和凋亡率的检测发现，p27mt可明显抑制细胞的增殖，阻滞细胞于g0/g1期，与对照组比较有明显的促凋亡作用，凋亡率达（37.9±3.32）%。
本课题前期研究发现大肠癌组织中p27呈低表达，且分化程度越低，表达越低。p27与肿瘤组织的分化程度及淋巴结转移密切相关[10]。本研究通过检测移植瘤组织中的金属蛋白酶9（mmp9）,发现p27mt能降低mmp9的表达。mmp9以酶原形式存在于胞质中，生理情况下释放到细胞外，降解细胞外基质，参与机体的生长发育及组织修复等多种生理过程[11]。当mmp9基因发生紊乱时，酶原生成增多，释放到胞外降解ⅳ、ⅴ胶原，层粘连蛋白等成分，破坏基底膜的完整性，在肿瘤的浸润转移过程中扮演着十分重要的角色[12]。本文观察到p27mt降低了mmp9的表达。本文还观察到在移植瘤生长的28天内，未见到肿瘤的转移。p27mt抑制肿瘤转移的机制是降低了mmp9的表达还是有其他机制，我们将进一步探讨。
综上所述，p27mt通过抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡而抑制大肠癌的生长，并对大肠癌的转移有一定的抑制作用。
【参考文献】
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