【摘要】 目的 以真核表达质粒pmu6为基础，针对bi1基因构建在细胞内表达短发夹状 rna (shrna) 的质粒载体，并观察它们对cne2z、cne1、ho8910pm、ho8910细胞株生长增殖的影响。方法 人工合成bi1寡核苷酸链，退火、定向克隆入pmu6载体中产生重组质粒，将重组质粒转染到细胞中，mtt比色法观察转染试剂及质粒载体对细胞生长增殖的影响。结果 与未处理组相比，bi1shrna对cne2z、cne1、ho8910pm细胞株的生长增殖有明显的抑制作用，而对ho8910细胞株的生长增殖无明显抑制作用。结论 重组质粒能在细胞内表达shrna，产生rna干扰(rna interference, rnai)效应并特异性抑制靶细胞的生长增殖，为质粒介导的rnai技术应用于鼻咽癌和卵巢癌的基因治疗提供一定的理论依据。
【关键词】 rnai 基因转染 bi1
rnai 指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链rna (doublestranded rna, dsrna)启动并介导与其同源mrna的特异性降解，从而抑制相应基因表达的过程[1]。在rnai过程中，细胞内小干扰rna (small interfering rna, sirna)的来源有不同的形式，以sirna表达载体(质粒或病毒载体)法的应用最为广泛。本研究以真核表达质粒pmu6为基础，针对bi1基因的5个不同位点设计并构建shrna表达质粒，以期在肿瘤细胞内表达sirna，并观察bi1shrna表达质粒在两种肿瘤细胞内介导的rnai效应对靶细胞生长增殖的影响。Www.11665.CoM
1 材料和方法
1.1 菌株、细胞株与质粒
大肠杆菌dh5α自卫生部武汉生物制品研究所引进；鼻咽癌低分化上皮细胞株cne2z、鼻咽癌高分化上皮细胞株cne1、高转移卵巢浆液性囊腺癌细胞株ho8910pm细胞株、卵巢浆液性囊腺癌细胞株ho8910自上海细胞生物所引进；pmu6质粒由本课题组构建并保存[2]。
1.2 试剂与仪器
rpmi1640培养基和小牛血清购于美国gibco公司；脂质体(lipofectmine tm2000)购于invitrogen公司；质粒dna小量提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；工具酶购于新英格兰生物公司(neb)和华美生物工程公司；四氮唑蓝(mtt)购于sinoamerican biotechnology公司；酶标仪为美国biorad公司产品；其他试剂均为进口或国产分析纯产品。
1.3 表达bi1shrna载体的构建及鉴定
根据reynolds等[3]的原则进行sirna序列的设计，从人bi1基因 (gi:23271 944)序列中选择position: 212～238、position: 350～376、position: 573～599、position: 735～761四个位点 (因bi1的cds为141～854)，分别命名为bi11、bi12、bi13、bi14，相应的重组质粒命名为pmu6bi11、pmu6bi12、pmu6bi13、pmu6 bi14；同时设计一个阴性对照sirna序列，命名为bi1s，相应的重组质粒命名pmu6bi1s。候选bi1 sirna序列需要经过genbank数据库的blast分析。sirna序列只列出正链序列：bi11 (27nt)正义链：5′gcagcacctgaagaaggtctatgcaag3′；bi12 (27nt)正义链：5′gctgatggcaacacctcatagccatga3′；bi13(27nt) 正义链：5′ggtatcttgatgtcagccctgagcttg3′；bi14 (27nt) 正义链：5′ggagatcaagattatatctggcactgc3′；bi1s (27nt) 正义链：5′ggtatcttgatgtgccacctgagcttg3′。表达shrna的转录模板是由9bp的连接片段将sirna序列的正义链(27nt)和反义链(27nt)连接而成的反向重复序列，5对shrna转录模板序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
将各shrna转录模板退火后，与bbsⅰ酶切后的pmu6大片段进行定向重组，然后转化，筛选阳性克隆。小量提取阳性克隆菌质粒dna后直接进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定；另各取1μg质粒dna进行pcr扩增，pmu6上游引物：5′cgacacggaaatgttgaa3′；pmu6下游引物：5′agggaagaaagcgaaagga3′。pcr扩增参数为94℃ 3min，94℃ 40s、52℃ 90s、72℃ 1min，共30个循环，最后72℃延伸7min。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr扩增产物，将经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定正确的阳性克隆菌进行测序鉴定。
1.4 细胞培养及转染
将cne2z、cne1、ho8910pm、ho8910细胞株常规传代培养于rpmi1640培养液中，取对数生长期细胞用于实验，按照转染试剂操作手册进行转染实验[4]。
1.5 mtt比色法检测细胞的生长抑制率
实验设未处理组、lip (脂质体)组、pmu6质粒对照组、各重组干扰质粒组。各组的质粒浓度为2mg/l(0.2μg/孔)；lip组按转染相应浓度质粒所需用量设计其终浓度。转染48h后，每孔加入10g/l mtt 10μl，培养4h后，加二甲基亚砜100μl，测定波长570nm和630nm处的吸光度a值。每组设4个平行孔，结果取平均值，重复3次实验。按以下公式计算细胞生长抑制率：抑制率(%) = (1－实验孔a值/对照孔a值)×100 %。
1.6 统计学方法
实验数据以±s表示，采用spss13.0 for windows统计软件，进行单因素方差分析和差异显著性检验。p>0.05为差异无统计学意义，p<0.05为差异有统计学意义，p<0.01为差异有显著统计学意义。
2 结果
2.1 表达bi1 shrna重组质粒的鉴定
将提取的质粒进行1%普通琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。电泳结果与理论值 (质粒pmu6为4 856bp，质粒pmu6bi11、pmu6bi12、pmu6bi13、pmu6bi14和pmu6bi1s均为4 614bp)相符。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr扩增产物，结果见图2。各重组质粒的pcr扩增产物为752bp，而质粒pmu6的pcr扩增产物为994bp，电泳结果与理论值相符。
2.2 各重组质粒表达的bi1 shrna对cne2z、cne1、ho8910pm、ho8910细胞生长增殖的影响
为了观察针对bi1设计的sirna序列对cne2z、cne1、ho8910pm、ho8910细胞株的抑制效率，我们用上述重组质粒对cne2z、cne1、ho8910pm、ho8910细胞株进行转染实验，mtt结果见表1～4。表1 脂质体介导的重组质粒对cne2z细胞生长抑制作用
3 讨论
rnai是由dsrna介导的同源mrna特异性降解现象。目前rnai作为一种新的反向遗传学手段引起了人们的广泛关注，自2001年tuschl首先成功地将rnai技术用于哺乳动物细胞起[5]，rnai不但被应用于哺乳动物细胞的基因功能分析，还被广泛用于肿瘤的基因治疗。
本文所选择的靶基因bi1是近年发现的一种凋亡抑制因子，不属于与程序性细胞死亡(programmed cell death, pcd)有关的任何基因家族，是少数几种同时存在于动物和植物中的保守性细胞死亡抑制因子之一；在动物中，bi1是受bcl2和bax调控的细胞死亡通路上的新型调节因子。与相应的正常细胞相比，bi1在前列腺癌[6]、原发性乳腺癌[7, 8]细胞中的表达上调4倍到10倍；另外，在子宫癌、卵巢癌和肺腺癌细胞[9]中也发现bi1基因表达的上调，这些表明，bi1基因的过表达可能与多种肿瘤的发生发展密切相关。运用rnai技术阻抑bi1基因在人前列腺癌、原发性乳腺癌中的表达, 已获得了诱导肿瘤细胞凋亡的满意结果，故bi1有望成为这些肿瘤潜在的预后标志。文献报道[8]，bi1在某些肿瘤细胞中的表达不依赖于肿瘤细胞的分化程度。据已检索到的文献，迄今国内尚无通过阻抑bi1基因表达诱导肿瘤细胞凋亡的相关研究报道，故本研究选择具有不同分化程度的鼻咽癌细胞和具有不同转移潜能的卵巢癌细胞进行初步的研究。
本研究构建的质粒载体可在细胞内表达针对bi1的shrna，shrna在细胞内酶的作用下可迅速形成sirna[10]，故可观察它们在不同肿瘤细胞内产生的rnai效应对细胞生长增殖的影响。在mu6启动子作用下，重组质粒所表达的shrna如图3(只列出pmu6bi11重组质粒表达的shrna，其他类似)。
本课题组经实验证实cne2z和cne1细胞中均有bi1基因的表达且表达量的差异无统计学意义。把表达bi1 shrna的质粒转染至cne2z、cne1细胞中，发现针对bi1的不同sirna序列对cne2z、cne1细胞生长增殖均有较强的抑制作用。统计学分析表明，通过阻抑bi1基因表达对鼻咽癌细胞生长增殖的影响并不依赖于鼻咽癌细胞的分化程度，故初步推测：利用rnai技术阻抑bi1基因表达抑制鼻咽癌细胞生长增殖进而诱导鼻咽癌细胞凋亡的过程中，cne2z和cne1细胞发生凋亡的机制可能是相同或相似的，具体的机制有待于进一步的研究。
本课题组经实验证实ho8910pm和ho8910细胞中也有bi1基因的表达且表达量的差异无统计学意义。当转染表达bi1 shrna的干扰质粒至ho8910pm 和ho8910细胞中时，发现它们对ho8910pm的生长增殖均有较强抑制作用，而对ho8910细胞的生长增殖无明显抑制作用。肿瘤细胞的生长、增殖、分裂与细胞周期的调控密切相关，一些基因及其产物如p53、p21、cyclin d1、pcna 等是细胞周期调控中重要的调控因子[11]。由于ho8910pm和ho8910细胞在癌基因和抑癌基因、转移基因和抑转移基因、凋亡基因和存活基因等的表达上存在差异[12]： ho8910pm细胞中，p21、cyclin d1、cd44v6、凋亡连接基因2(alg2)[13]、突变型p53、egfr等的表达强度大于ho8910细胞； ho8910pm细胞中，nm23、p16的表达强度弱于ho8910细胞，所以，这两株细胞在生长、增殖等过程中具有各自的生物学特征。肿瘤的发生和发展是一个多基因参与，经过多阶段协同作用的结果，某一基因的变化仅仅影响肿瘤一定阶段的某些生物学特征。本文通过阻抑bi1一个基因表达，观察到对ho8910pm和ho8910细胞生长增殖影响的差异，可能与这两株具有不同转移潜能的卵巢癌细胞中蛋白表达存在明显差异有关，具体机制还有待进一步地研究与探讨。
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