IL1β对成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白作用及机制的论文_基础医学论文

il1β对成纤维细胞合成ⅰ型胶原蛋白作用及机制

【关键词】白细胞介素1;p38信号通路;硬膜外隙;瘢痕;成纤维细胞;胶原蛋白

【摘要】 目的研究白细胞介素1β (il1β)对成纤维细胞合成ⅰ型胶原蛋白的作用及机制，以探讨il1β对硬膜外瘢痕形成的影响。方法将nih3t3细胞随机分为il1β组、il1β+sb202190(p38 mapk特异性阻断剂)组和对照组,各组经无血清培养20 h后，il1β组加入10 μg/l的il1β，il1β+sb202190组用10 μmol/l的sb202190预作用1 h后加入10 μg/l的il1β，对照组直接加体积分数0.02的血清。各组培养24 h后收集细胞，采用rtpcr法检测ⅰ型胶原α2基因(col1a2)mrna的表达，western blotting法检测col1a2蛋白的表达。结果 il1β组col1a2 mrna和col1a2蛋白表达均明显低于il1β+sb202190组和对照组，差异有显著性(f=55.67、251.01,q=11.88～28.79,p<0.01);il1β+sb202190组低于对照组，但差异无显著性(q=1.88、2.93,p>0.05)。结论 il1β可能通过抑制nih3t3细胞col1a2的合成而抑制硬膜外瘢痕的形成，p38信号通路在il1β抑制瘢痕形成过程中起到重要的作用。wwW.11665.cOM

【关键词】白细胞介素1;p38信号通路;硬膜外隙;瘢痕;成纤维细胞;胶原蛋白

　mechanism of interleukin1β affecting typeⅰ collagen synthesis by fibroblast li xuesen, chu yanchen, zou yunwen, et al (department of orthopaedics, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china); [abstract] objective to investigate the role and mechanism of interleukin1β in the synthesis of typeⅰ collagen by fibroblast so as to explore the impact of interleukin1β on the formation of epidural scar. methods the nih3t3 cells were divided into three groups: il1β group, il1β + sb202190 (specific p38 mapk blocker) group and control group. after serumfree culturing for 20 hours, 10 μg/l of il1β was added to il1β group. the il1β + sb202190 group was treated with sb202190 (10 μmol/l) for 1 hour before adding il1β (10 μg/l), and the control group received same volume of 2% serum. after culturing for another 24 hours, cells were collected, and both mrna and protein expressions of typeⅰ collagen a2 (col1a2) detected with rtpcr and western blotting, respectively. results the mrna and protein expressions of col1a2 in il1β group were significantly lower than that of the il1β + sb202190 group and the control group (f=55.67, 251.01;q=11.88-28.79;p<0.01). the expressions of col1a2 mrna and protein in il1β + sb202190 group were lower than that of the control group, but the difference was not significant (q=1.88,2.93;p>0.05). conclusion il1β might inhibit the formation of epidural scar by inhibiting the expression of col1a2 in nih3t3 cells, and p38 signaling pathway may play an important role in the process of scar formation.

　　[key words] interleukin1; p38 mitogenactivated protein kinase; cicatrix; epidural space; fibroblasts; collagen

　　硬膜外瘢痕是腰椎手术失败综合征(fbss)的重要原因之一，约占fbss的5%～24%[12]。对硬膜外瘢痕的防治长期以来缺少有效措施,而目前最前沿的细胞因子疗法对瘢痕的治疗取得了较好效果[34]。白细胞介素1β(il1β)是一类重要的前炎症因子,在体内的组织损伤修复过程中起到重要的作用。p38 mapk信号通路是目前丝裂原激活的蛋白激酶(mapk)通路中的一个重要成员,参与细胞对许多外界刺激的调节反应[56]。本研究应用il1β以及p38 mapk的特异性阻断剂(sb202190)作用nih3t3细胞，从胶原基因的转录水平调控及蛋白水平调控来研究il1β在纤维化过程中的作用及其机制，以期为硬膜外瘢痕的防治提供理论依据。现将结果报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验试剂

　　nih3t3小鼠胚成纤维细胞(中国科学院上海细胞库)，胎牛血清(杭州四季青公司)，dmem高糖培养基和2.5 g/l胰蛋白酶(gibco 公司)，小鼠il1β(peprotech 公司),p38 mapk特异性阻断剂sb202190(sigma 公司)，ripa裂解液(碧云天生物技术有限公司),以ⅰ型胶原α2基因(col1a2)兔多克隆抗体和βactin鼠单克隆抗体(santa cruz公司)为一抗,辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠igg和山羊抗兔igg(santa cruzs公司)为二抗, trizol rna提取液和rtpcr试剂盒(大连宝生物工程有限公司),小鼠col1a2 mrna及内参照(gapdh)的pcr引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)，化学发光剂(北京全式金生物技术有限公司),4×上样缓冲液(solarbio公司)。

　　1.2 实验分组与处理

　　nih3t3细胞在含体积分数0.10胎牛血清的dmem高糖培养基中常规培养,选择对数生长期的nih3t3细胞，用2.5 g/l的胰酶消化成单细胞悬液，按约0.5×108/l的密度以均等的细胞数分别分装到3个25 cm2培养瓶中，于37 ℃、体积分数0.05 co2培养箱中培养，待融合达70%～80%时,随机分为il1β组、sb202190+il1β组及对照组，各组经无血清dmem培养20 h后，更换培养液。il1β组加入浓度10 μg/l的il1β;il1β+sb202190组用10 μmol/l的sb202190预作用1 h后更换培养液,加入浓度10 μg/l的il1β;对照组直接加含体积分数0.02胎牛血清的培养基。经上述换液后,继续培养24 h，收集细胞。

　　1.3 检测指标及方法

　　1.3.1 col1a2 mrna表达的检测应用逆转录聚合酶链反应(rtpcr)法。细胞培养24 h后，按照trizol细胞裂解液说明提取细胞总rna，所获样品总rna的a260/a280比值为1.8～2.0。取2 μg总rna按照逆转录试剂盒说明书方法行逆转录反应,合成cdna,随后进行pcr扩增。引物设计应用primier 5.0软件，计算机完成。pcr引物序列:①小鼠col1a2:上游引物5′ctctgtcctagtcgatggctgc3′,下游引物5′acggaattcttggtcagcacc3′,扩增片段长为142 bp;②gapdh:上游引物5′gcattgtggaagggctca3′,下游引物5′gggtaggaacacggaagg3′,扩增片段长207 bp。扩增条件:94 ℃预变性5 min;然后94 ℃变性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s,共扩增35个循环;最后72 ℃延伸10 min。pcr产物行溴乙锭染色的0.02 g/l琼脂糖凝胶电泳,用uvp凝胶分析系统扫描、分析电泳带的灰度,以col1a2扩增条带灰度与扩增gapdh条带灰度之比表示col1a2 mrna表达水平。

　　1.3.2 col1a2蛋白表达的检测采用western blotting法。细胞培养24 h后,采用ripa裂解液(400 μl ripa+4 μl pmsf)裂解细胞提取细胞总蛋白，取50 μg蛋白上样行100 g/l sdspage电泳、转膜、封闭。分别使用col1a2兔多克隆抗体(1∶200)和βactin 鼠单克隆抗体(1∶500)孵育,室温轻摇2 h后，4 ℃过夜,再用tbs洗涤3次(每次10 min),分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg(1∶5 000)和山羊抗小鼠igg(1∶5 000)室温孵育120 min,tbs洗涤3次(每次15 min)后,最后x线片曝光、显影和定影后观察结果。

　　1.4 统计学处理

　　应用spss 13.0和ppms 1.5[7]统计学软件进行数据处理，结果以±s表示，各组间比较应用方差分析。p<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 各组col1a2 mrna表达的比较

　　il1β组col1a2 mrna的表达明显低于il1β+sb202190组和对照组，差异均有显著性(f=55.67,q=11.88～13.76,p<0.01),il1β+sb202190组表达虽低于对照组，但差异无显著性(q=1.88,p>0.05)。见图1和表1。

　　2.2 各组col1a2蛋白表达的比较

　　il1β组col1a2蛋白表达明显低于il1β+sb202190组和对照组，差异有显著性(f=251.01，q=25.86～28.79,p<0.01);il1β+sb202190组col1a2蛋白表达虽低于对照组，但差异无显著性(q=2.93,p>0.05)。见图2和表1。

　　3 讨论

　　硬膜外瘢痕又称硬膜外纤维化,是指在硬膜外隙的手术涉及范围内形成的瘢痕或组织纤维化,是机体对创伤的修复反应,每例腰椎手术后病人都会发生。瘢痕的粘连收缩会牵拉硬膜和神经根,限制其活动;被瘢痕包绕的神经根受到非正常的牵拉和挤压,神经纤维的轴浆运输、动脉血供、静脉回流受影响,神经根和背侧神经节对机械压迫很敏感,会产生一系列症状,如疼痛、麻木、下肢肌力降低等。

　　在纤维化疾病中，异常沉积在组织器官的细胞外基质以胶原为主，尤其是ⅰ型胶原等纤维性胶原，最终使组织器官硬化导致功能障碍或丧失，因此，对胶原的调控显得尤为重要。而最近有文献报道，il　①对照组，②il1β组，③il1β+sb202190组，④、⑤、⑥分别为①、②、③的gapdh内参。

　　图1 rtpcr检测靶细胞中col1a2 mrna的表达

　　①对照组，②il1β组，③il1β+sb202190组。

　　图2 western blotting 检测靶细胞col1a2蛋白的表达表1 各组细胞col1a2 mrna和蛋白表达1β可以抑制肌腱成纤维细胞胶原的表达[8]，提示il1β可能对瘢痕的形成有作用。然而，il1β对纤维化疾病作用的研究报道较少。本文通过观察il1β对nih3t3细胞col1a2 mrna和蛋白表达的影响，来研究il1β对瘢痕的作用。il1β是一种具有多种生物活性的炎症细胞因子,能调节局部和系统的炎症反应,在组织损伤的修复过程中发挥着重要作用。而nih3t3细胞是常被用作抗纤维化药物的筛选和机制研究的成纤维细胞系。本文的实验结果显示，一定浓度的il1β能够抑制成纤维细胞col1a2的合成。而col1a2合成的减少，在一定程度上可以使组织纤维化的机会减少。由此可以推测，il1β在纤维化疾病过程中通过抑制成纤维细胞胶原蛋白的合成，一定程度上可以减少胶原的异常沉积，从而抑制瘢痕的形成。然而，还有文献报道，il1β能促进大鼠心肌成纤维细胞基质金属蛋白酶(mmps)表达[8]，而mmps可以降解胶原蛋白等细胞外基质，在组织重构方面起重要的作用。所以，il1β在抑制瘢痕形成方面是否有更强大的作用还有待进一步的研究。

　　对于il1β如何调节成纤维细胞胶原合成的研究报道尚少。目前，有文献报道，在p38通路il1β调整大鼠心肌成纤维细胞mmps表达中起重要作用[9]。而p38通路可被应激刺激(紫外线、h2o2、热休克和低氧等)、炎性因子(tnfα、il1 和il6等)及lps和革兰阳性细菌细胞壁成分激活，参与炎症、应激等许多病理生理反应。本文的研究结果表明,应用p38 mapk激酶阻断剂sb202190(浓度为10 μmol/l)处理细胞后，可明显减弱il1β对成纤维细胞col1a2 mrna及蛋白表达的作用。说明p38通路在il1β抑制成纤维细胞col1a2表达的过程中起了重要的作用。

　　综上所述, il1β能抑制成纤维细胞ⅰ型胶原mrna的表达和蛋白的合成,减少胶原的合成，使胶原异常沉积的机会减少，从而对瘢痕的形成起到一定的抑制作用。而p38信号通路作为重要信号转导途径之一，在预防瘢痕形成、调节纤维化的过程中发挥重要作用。

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