【摘要】 目的：评价骨髓基质细胞移植对组织羟脯氨酸(hyp)含量的影响，探讨细胞移植对心肌梗塞后心室重塑机制。方法：30只日本大耳白兔，随机分为骨髓基质细胞(msc)组、安体舒通组、对照组。体外穿刺提取骨髓, 分离、培养骨髓基质细胞，msc组、对照组心肌梗塞模型制作成功2周后沿梗塞周边区域注射骨髓基质细胞悬液(3×109/100μl)或dmem培养基100 μl，安体舒通组模型制作成功后服用安体舒通20 mg。心脏超声评价心功能，测定血浆、心肌组织hyp含量、基质金属蛋白酶(mmp-9)含量，以氯化四唑(ttc)染色评价梗塞面积。结果：与对照组、安体舒通组相比，msc组心功能提高[lvef:(53.22±2.13)%∶(56.91±2.04)%∶(62.61±2.37)，p<0.05];梗塞面积下降: (29.73±2.11)%∶(28.61±1.24)%∶(22.82±3.12)%，p<0.05;血浆hyp含量(μg/ml)显著下降[(40.16±2.31)∶(34.24±1.98)∶(22.79±1.69)， p<0.05];心肌组织hyp含量(μg/mg湿重)显著下降[(3.59±0.19)∶(2.67±0.81)∶(1.59±0.89)， p<0.05];血基质金属蛋白酶含量(mmp-9，μg/l)显著增加[(218.64±115.23)∶(248.16±103.9)∶(719.25±312.2)，p<0.05]。wwW.11665.cOM结论：细胞移植可抑制组织羟脯氨酸合成，促进基质金属蛋白酶表达，增加心肌胶原降解，表明干细胞移植可抑制心肌胶原合成、抑制心肌局部间质纤维化，是细胞移植心功能改善机制之一。
【关键词】 骨髓移植;心室重构;羟脯氨酸
effect of marrow stromal cell transplantation on constitution hydroxyproline of myocardial infarction in rabbit/yi xianfu，fang zhicheng，yang xianyi，xiao min，zhang xuguo，zhu yanxia，jiang ronghua，zhang zeyue//chinese journal of cardiovascular rehabilitation medicine，2009，18(4):321
abstract：objective:to assess the effect of marrow stroma cell transplantation on constitution hydroxyproline of myocardial infarction in rabbit.methods:isolated mscs from 30 rabbits by bone marrow puncture were cultured in cell culture. cell implanted on two weeks after the left anterior descending branch was ligated. rabbits was divided into control group,antisterone group and cell implanted group. the 100μl dmem or cell suspension was injected into the border area of myocardial infarction. the heart function was assessed by echocardiography before and after cell implanted 4 weeks. the area of infarction were estimated by ttc. the constitution hydroxyproline and mmp-9 were estimated.results: compared with control group and antisterone group, cardiac function ameliorated[lvef:(53.22±2.13)% vs.(56.91±2.04)% vs.(62.61±2.37)%，p<0.05];the area of infarction[(29.73±2.11)% vs.(28.61±1.24)% vs.(22.82±3.12)%，p<0.05];plasma hydroxyproline reduced[(40.16±2.31)vs.(34.24±1.98) vs.(22.79±1.69)， p<0.05], and constitution hydroxyproline also reduced[(3.59±0.19) vs.(2.67±0.81) vs.(1.59±0.89)， p<0.05]; the mmp-9 increased[(218.64±115.23) vs.(248.16±103.9) vs.(719.25±312.2)，p<0.05]in msc group.conclusion:the result show that mesenchymal stem cells transplantation can obviously ameliorate cardiac function, decrease infarction area and myocardium fibrosis.
key words：bone marrow transplantation;ventricular
remodeling; hydroxyproline
心肌梗塞(mi)后心肌间质纤维化是心室重塑重要因素，更是梗塞后心衰、恶性心律失常等心血管事件发生的病理生理基础。传统药物、介入手术对心室重塑疗效有限。研究发现骨髓基质细胞(marrow stramal cell，msc) 移植可改善心功能、心室重塑，其机制尚不明确。心肌羟脯氨酸(hydroxyproline,hyp)是心肌胶原合成标志物之一。本研究观察msc移植对mi后hyp表达的影响，探讨细胞移植对mi后心肌间质纤维化的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料
3～5月龄日本大耳白兔30只(武汉大学医学院实验动物中心提供)，体重2～2.5 kg，雌雄不限，随机分为对照组、安体舒通药物治疗组及细胞移植组。胎牛血清(hyclone公司)，dmem培养基(hyclone公司)，percoll分离液(sigma公司)，氯化四唑 (2，3，5-triphenyl tetrazolium chlorid，ttc，上海捷倍思基因技术有限公司)。相差显微镜(olympusx170，日本)，彩色多普勒诊断仪(diasonics gatewayfax，美国)，北航医学图像分析管理系统(hpias-1000)，羟脯氨酸试剂盒(南京建成工程研究所，中国)。
1.2 方法
1.2.1 兔骨髓基质细胞(msc)分离培养： 见参考文献[1]。
1.2.2 细胞移植： 以10%乌拉坦经耳缘作静脉麻醉，结扎前降支，制作mi模型。2周后，msc组、对照组分别沿梗塞周边区域随机选取6个位点依次等量注射细胞悬液或dmem培养基100 μl(其中5×107细胞/位点)，每一实验动物局部移植的细胞总数量3×109。安体舒通组给予安体舒通20 mg，2次/d，服用1月。
1.2.3 心功能、心室重塑评估:细胞移植前、后4周，彩色多普勒超声检查。测定左室收缩末期内径(lvesd)、左室舒张末期内径(lvedd)、左室后壁厚度(lvpwh)，左室短轴缩短率(fs)，每搏输出量(sv)，左室射血分数(lvef)等。
1.2.4 梗塞面积评估： 细胞移植后4周处死动物，自左室心尖至心底每2 mm连续切片5张，置入2%ttc溶液，37℃温箱染色30 min。图象分析仪计算梗塞区域在各层心肌中所占比例，重复3次，取平均值，即为梗塞面积。
1.2.5 血浆、组织羟脯氨酸含量测定：以样本碱水解法测定血浆、组织hyp含量。分别于耳缘静脉取血0.5 ml及梗塞区域取3小块左室梗塞心肌组织检测血浆、组织hyp含量，测定湿重30～100 mg，置入玻璃试管，加1 ml水解液，混匀，95℃水解20 min，流水冷却加指示剂1滴，依次加入调ph甲乙液，使ph值维持在6～6.8，取3～4 ml稀释水解液加适量活性炭，混匀，3 500 r/min，离心10 min，取上清液1 ml，依次加入hyp试剂1，2，3各0.5ml，并混匀静置5 min，60℃水浴15 min，冷却后，3 500转/min，离心10 min，取上清液在550nm处，1cm光径，蒸馏调零，测定空白管及标准管、测定管吸光度。组织hyp含量(μg/mg湿重)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管含量(5μg/ml)×水解液总体积(10ml)/组织湿重(mg);血浆hyp含量(μg/ml)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管含量(5 μg/ml)×水解液总体积(ml)/取样量(ml)。
1.2.6 基质金属蛋白酶(mmp-9)检测：采用夹心酶联免疫吸附法(elisa)，试剂盒 (humen mmp-9 kit1quantikine)为美国 r & d system公司提供，质量浓度单位为μg/l，灵敏度为0.156μg/l。
1.3 统计学处理
由spss10.0统计软件完成，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析、q检验，p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 细胞培养
刚接种的细胞呈球形悬浮于培养液。第3～4 d可见少量单个核细胞贴壁，呈梭形或索条形，分布不均，6～12 d贴壁细胞逐渐增多，部分呈巢状生长，形成多个成纤维样细胞集落，16～20 d 细胞逐渐汇集成片可以传代。
2.2 心脏超声结果评价
与对照组相比，msc组、安体舒通组lvef、fs、sv显著提高，lvesd、lvedd显著缩短(p均<0.05)，但各组间室壁厚度无显著差异，见表1。表1 细胞移植对心功能影响(±s)注：各组治疗后与对照组相比△p<0.05，msc移值与安体舒通组相比▲p<0.05。
2.3 血浆、组织羟脯胺酸及基质金属蛋白酶(mmp-9)含量测定结果
对照组的血清、组织内hyp含量高于其余两组，细胞移植组最低，差异有显著性(p<0.05～<0.01)，而细胞移植组的mmp-9含量显著高于其余两组(p<0.05)，见表2。表2 血浆、组织羟脯胺酸(hyp)含量比较注：与对照组比较△p<0.05，△△p<0.01;与安体舒通组比较▲p<0.05。
2.4 梗塞面积变化
ttc染色显示对照组心肌梗塞坏死心肌包括心内膜、心肌层、心外膜，表现为局部颜色苍白，细胞移植组则局限于心外膜或心外膜下(图1)，分布范围小于对照组。
图1 ttc(氯化四唑)染色评价梗塞面积
注：ttc染色结果[梗塞面积(左右)依次为：对照组(29.73±2.11)%;安体舒通组(28.61±1.24)%;msc组(22.82±3.12%)]。msc组与对照组及安体舒通组相比，p<0.05。
3 讨 论
心肌梗塞后心肌缺血坏死，心肌间质纤维结缔增生，导致心室重塑，进一步引起心力衰竭、心律失常和心源性猝死等严重并发症。阻止或逆转心室重塑的进展，将会延缓并发症的发生，提高患者的生存率。因此通过干预心肌间质纤维化，对于改善心室重塑具有积极意义。
病理情况下，心肌局部既存在心肌胶原合成，同时也有心肌胶原降解过程，心肌间质胶原保持合成与降解动态变化。hyp是胶原纤维，尤其是心肌i 型胶原主要成分之一，其含量占胶原纤维85%以上，代表着心肌胶原纤维合成，而mmp则通过降解胶原纤维，抑制心肌纤维化。检测细胞移植后hyp及mmp含量变化，可了解心肌间质纤维化情况。
与对照组相比，msc组、安体舒通组血浆、心肌局部组织hyp低、mmp-9浓度高，表明两组心肌胶原形成减少，尤其i型胶原纤维形成减少，而胶原降解强，对心室重塑效果好，msc组更为明显。其原因可能为：(1)msc促进心肌再生和血管新生。研究证实msc在心肌局部环境中可分化为心肌样细胞及内皮细胞，前者促进心肌再生，后者则促进血管新生。ttc染色显示细胞移植组坏死心肌集中在心内膜，而心内膜、心肌层极少，而对照组坏死心肌则广泛分布于心内膜、心肌层、心外膜，细胞移植后心肌坏死区域和范围减小，提示细胞移植促进心内膜、心肌层心肌再生，从源头上预防心肌胶原合成，因此心肌间质hyp含量也降低[1，2]。mmp-9含量高，可能与msc分化为内皮细胞，促进血管新生，心肌局部缺血改善，心肌胶原分解增加有关;(2)本研究前期研究表明，移植细胞表达心房利钠肽，已证实其可使细胞内环磷鸟苷(cgmp)浓度升高，刺激核丝氨酸-苏氨酸激酶(akt)基因激活，后者能够抑制缺血心肌hyp表达[3～5];(3)心肌缺血环境可促进体内生物活性因子释放，如转化生长因子-β1(tgf-β1)，它是目前最有效的促纤维化细胞因子，可促进胶原和结缔组织生长因子等细胞外基质上调和分泌增强，促进成纤维细胞增殖，增加胶原的生成。但在骨髓基质细胞移植中，移植细胞局部分化内皮细胞，一定程度上改善局部缺血环境，抑制了生物活性因子作用，减少心肌局部胶原的生成，故也是msc组hyp含量最低原因之一[6，7]。
与安体舒通组相比，msc组羟hyp含量更低，能够更好抑制心肌胶原纤维合成，原因可能在于安体舒通仅抑制心肌局部血管紧张素—ii、醛固酮介导的成纤维细胞增殖，其抗心肌纤维化作用程度有限，而mcs移植可从多个环节干预心肌胶原合成，同时促进mmp表达，增加心肌胶原降解。
【参考文献】
[1]蒋 雯，林国生，李庚生，等.兔骨髓间充质干细胞自体移植对缺血心肌心功能的影响[j].临床心血管病杂志，2004，20(10):605-608.
[2]张 蕾，陈 沅，田 杰，等.骨髓间充质干细胞心肌样分化的微环境因素[j].临床心血管病杂志，2006，22(11)：686-688.
[3]方志成，周昌娥，王 玮，等.5-氮胞苷对培养兔骨髓基质细胞心房利钠肽表达的影响[j].心肺血管病杂志，2006，25(2)：118-121.
[4]kato t，muraski j，chen y，et al.atrial natriuretic peptide promotes cardiomyocyte survival by cgmp-dependent nuclear accumulation of zyxin and akt[j].journal of clinical investigation，2005，115(10):2716-2730.
[5]mangi aa，noiseux n，king d，et al.mesenchymal stem cells modified with akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts[j].nat med，2003，9(9):1195-1201.
[6]makkar r，price m，lill m，et al.intramyocardial injection of allogenic bone marrowderived mesenchymal stem cells without immunosuppression preserves cardiac functiong in a porcine model of myocardial infarction [j].journal of cardiovascular pharmacology therapeutics，2005，10(4): 225-233.
[7]dai c，chung ij，krantx sb，et al.in human immature bfue tumor necrosis factoralpha not only downregulates cdk6 but also directly produces apoptosis which is prevented by stem cell factor[j].exp hematol，2004，32(10):911-917.
