【摘要】目的：研究mmp- 2在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达，并与宫颈癌患者年龄、淋巴结转移与否、临床分期进行比较，探讨其与宫颈癌侵袭/转移的关系。方法：应用rt-pcr的方法检测48例宫颈癌组织、正常宫颈组织及16例宫颈良性病变组织中mmp-2 的表达情况，并对数据进行分析。结果：mmp-2在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达率分别为64.58%、37.50%、31.25%，宫颈癌与正常宫颈组织（p=0. 012）、宫颈癌与宫颈良性病变组织（p=0. 031）间的mmp-2表达率差异有统计学意义，而正常宫颈组织与宫颈良性病变组织之间的mmp-2表达率差异无统计学意义（p=0.091）。mmp-2在不同临床分（p=0.001）及淋巴结转移（p=0.002）中的表达率存在显著差异，但在不同年龄患者的癌组织中mmp-2的表达率无差异（p>0.05）。结论：mmp-2在宫颈癌中的表达率明显高于正常宫颈组织及宫颈良性病变组织mmp-2与宫颈癌临床分期密切相关，临床分期越晚，其肿瘤组织中mmp - 2的表达率越高。伴淋巴结转移宫颈癌mmp - 2表达率高于无淋巴结转移者。mmp-2表达率与患者年龄无关。
【关键词】宫颈癌，机制金属蛋白酶－2 ，逆转录聚合酶链式反应
【abstract】objective:to study the expression of mmp-2 in human cervical cancer and explore the relationship between mmp-2expression and clinicalpathological feature（s patient’s age,limph node metastasis,clinical stage,）. method：the expression of mmp-2 in 48 cases of human cervical cancer tissues,normal cervical tissues and 16 cases of cervical benign lesion tissues was detected by reverse transcriptase polymerase chainreaction (rt-pcr).results: theexpression rate of mmp-2 in cervical cancer，normal cervical tissues and cervical benign lesion tissue were 64.58%、37.50%、31.25%,statistical difference wasfound among cervical carcinoma group,normal cervical tissues group and benign lesion group.the expression of mmp-2were associated with clinical stage (p=0.001) and lymph node metastasis (p=0.002),but had no correlation with age and tumor size (p>0.05).conclusion:mmp-2expression is increased in cervical cancertumor tissues compared with normal tissues and cervical benign lesion tissue,mmp-2 is relevant with the occurrence of cervical cancer.the cervical cancer cellsproliferation capacity is increase,degree of malignancy is higher and facilitates metastasis occurred which mmp-2 expressed.
【key words】cervical cancer,mmp-2,rt-pcr
基质金属蛋白酶家族(mmps)是一类活性依赖金属锌离子的蛋白酶,可以有效地降解基底膜和细胞外基质(ecm),从而参与促进肿瘤生长、浸润和转移[1]。wwW.11665.coM基质金属蛋白酶-2(mmp-2)是mmps家族的重要一员,在多种肿瘤中存在过表达,对肿瘤的侵袭和转移起重要作用。本研究对mmp-2在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达进行检测，并与宫颈癌患者年龄、淋巴结转移与否、临床分期进行比较，探讨其与宫颈癌侵袭转移的关系。
1 材料与方法
1.1 标本来源 标本均来自我院2006年10月～2009年10月期间住院手术切除标本共112例。其中宫颈良性病变组织16例（宫颈糜烂10例、宫颈息肉3例、宫颈肥大3例）、宫颈癌组织（病理证实为鳞状细胞浸润癌及宫颈腺癌）及正常宫颈组织（因子宫肌瘤行子宫全切患者）各48例。病理分级根据2006年修订的国际妇产科联盟（figo）宫颈癌分期，0期5例，ⅰ期28例，ii12例，ⅲ期3例；伴淋巴结转移30例，无淋巴结转移18例；全部患者术前均未行任何抗癌治疗。所有患者均为女性，宫颈癌患者中位年龄48岁（18～77岁）；宫颈良性病变患者中位年龄34岁（22～43岁）。
1.2 组织总rna的提取和cdna的合成 总rna的提取参照trizol试剂说明书操作,所得rna用75%乙醇洗涤后晾干,溶于20ml depc水中,再经微量核苷酸定量检测仪测定rna浓度及a 2 6 0 /a 2 8 0, 琼脂糖凝胶电泳检测r na质量,选取a260/a280比值为1.8-2.0的rna进行反转,所得的cdna产物在-20℃保存,用于下一步pcr。
1.3 逆转录反应 在20μl的反应体系中加入5×reactionbuffer4μl，olig（o dt）18prime（r 0.5μg/μl）1μl，ribolock tmribonuclease inhibitor（20u/μl）1μl，10mm dntp 2μl，总rna2μg，逆转录酶m-mlv1μl，depc水补齐至20μl，42℃孵育60min（逆转录），72℃孵育10min以终止反应，于冰上降温（灭活逆转录酶）。
1.4 pcr反应 扩增mmp-2基因的引物序列，上游引物actttggccgctgggagcat，下游引物：ggcgctggtgcagctctcat，扩增产物长度410bp，β-actin为内参照，上引物：caacttcatccacgttcacc，下游引物：gaagagccaaggacaggtac，扩增产物长度268bp。25μl的反应体中加入cdna2μl，lox上、下游引物各1μl，pcr master mx12.5μl，去离子水8.5μl混匀后，置于pcr仪中，反应条件：95℃预变性10min后，95℃30s，61℃30s，72℃30s，40个循环，最后72℃延伸10min。
1.5 pcr产物鉴定 用1.0%琼脂糖凝胶将提取的rna进行电泳，在紫外线灯下观察。
1.6 统计分析 计数资料采用2检验及四表格确切概率法，采用spss 13.0软件进行统计学处理。
2 结果
2.1 mmp-2在宫颈癌、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达mmp-2在宫颈癌组织中的表达率为64.58%，而在正常宫颈组织和宫颈良性病变组织中的表达率分别为37.50%、31.25%。统计学分析，宫颈癌与正常宫颈组织（p=0.012）、宫颈癌与宫颈良性病变组织（p=0.031）间的mmp-2表达率差异有统计学意义，而正常宫颈组织与宫颈良性病变组织之间的mmp-2表达率差异无统计学意义（p=0.091）。见表1。
2.2 mmp-2与临床病理特征的关系0、ⅰ、ⅱ、ⅲ期宫颈癌mmp-2表达率分别为40.00%、39.29%、100.00%、100.00%，统计学分析，ⅱ、ⅲ期宫颈癌mmp-2的表达率明显高于0、ⅰ期（p=0.001）；伴淋巴结转移宫颈癌mmp-2表达率为80.00%，明显于无淋巴结转移的33.33%（p=0.002）；在18～50岁、>50岁的患者中mmp-2的表达率分别为60.60%、73.33%，差异无统计学意义（p＞0.05）。见表2。
3 讨论
宫颈癌侵袭转移是其重要的生物学行为,是导致患者死亡的主要原因。肿瘤的转移和浸润都需要降解其周围的基质和基底膜[2],使肿瘤细胞能够有更多的活动空间及进入周围组织的通道。肿瘤周围的细胞外基质和基底膜的主要成分为ⅳ型胶原和明胶,是金属基质蛋白酶的主要作用底物,至今[3],已经有20多种不同的mmps被克隆,其中mmp-2是其中作用较强的一种,也被认为是与肿瘤关系最为密的一种。mmp-2在体内以72-kda的非活化形式分泌,在膜型金属基质蛋白酶(mti-mmp)的作用下转化为67-kda的活化形式,降解ⅳ型胶原、纤维连接蛋白和层粘蛋白[4]。mmp-2几乎对细胞外所有的基质成分都有一定的降解作用。大量研究表明,在多种恶性肿瘤组织中存在mmp-2的过度表达。yoshino等[5]研究结果显示,黑色素瘤病人血清中mmp-2的含量高于正常对照组。langenskiold等[6]研究结果显示,直肠癌病人血浆mmp-1、mmp-2、mmp-9蛋白表达均升高,认为血浆mmp-2水平可作为肿瘤恶性程度的一个相关指标。hpv是宫颈癌发生的重要病因,smolahess等[7]发现hpv阳性宫颈癌细胞系中有mti-mmp的表达,过度表达的mtimmp通过活化mmp-2与宫颈癌细胞的侵袭性高度相关。在本研究中，mmp-2在正常宫颈组织及宫颈良性病变组织的表达率分别为37.50%、31.25%，且差异均无统计学意义，提示mmp-2在宫颈良性病变的发生中作用并不十分明显。而在宫颈癌中mmp-2高达64.58%，高于正常宫颈组织及良性病变组织，表明mmp-2的过度表达与宫颈癌的发生有关。hif-1在不同临床分期患者中的表达不完全相同，ⅱ期、ⅲ期宫颈癌患者癌组织中的表达率较0期、ⅰ期患者升高。该实验结果反映出mmp-2表达的变化趋势，即随着宫颈癌病情的进展，mmp-2的表达率呈上升趋势。在伴有淋巴结转移的患者中mmp-2的表达率明显高于无淋巴结转移患者，提示mmp-2可能与宫颈癌发生淋巴结转移有关。而mmp-2在不同年龄组的宫颈癌患者中的表达率在统计学上无显著差异（p>0.05），表明mmp-2与患者年龄无关。以上研究表明mmp-2与宫颈癌的生存率有关。mmp-2高表达者tnm分期晚,分化低,并易出现淋巴结转移,提示mmp-2可以作为判断宫颈癌恶性类型的有用指标。mmp-2表达率与患者年龄无关。
参考文献
[1] adithi m,nalini v,kanda l,et al.expression of matrixmetalloproteinases and their inhibitors inretinoblasto-ma[j].j pediatrhematol oncol,2007,29(6):399-405.
[2] takahashi e,tateyama h,akatsu h,et al.expressionof matrix metalloproteinases 2 and 7 in tumorcells correlates with the world health organizationclassification subtype and clinical stage ofthymic epithelial tumors[j].humpathol,2003,34(12):1253-1256.
[3] n a b e s h i m a k , i n o u e t , s h i m a o y , e t a l .matrixmetalloproteinases intumor invasion:role forcell migration[j].pathol int,2002,52(4):255-257.
[4] i t o h y , i t o n, n a g a s e h , e t a l .c e l l s u rf a c ecollagenolysis requires homodimerization of themembrane-bound collagenase mt1-mmp[j].mol biolcell, 2006,17(12):5390-5397.
[5] yoshio y,kageshita t,nakajima m,et al. clinicalr e l e v a n c e o f s e r u m l e v e l s o f m a t r i xmetalloproteinase-2,and tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1 and-2 in patientswith malignantmelanoma[j].dermatol,2008,35(4):206-214.
[6] langenskiold m,holmdahi l,falk p,et al. increasedplasma mmp-2 protein expression in lymph nodepositivepatients with colorectal cancer[j].int jcolorectal dis,2005,20(3):245-252.
[7] smola-hess s,pahne j,mauch c,et al. expression ofmembrane type 1 matrix metalloproteinase inpapillomavirus-positive cells:roles of the humanpapillomavirus(hpv)16 and hpv8 e7 gene products[j].j gen virol,2005,86(5):1291-1296.
