【摘要】 目的 探讨中药丹酚酸b预处理的内皮祖细胞（epcs）对急性心肌梗死(ami)大鼠移植骨髓间充质干细胞（bmscs）向心肌分化早期基因表达的影响。方法 密度梯度离心法和贴壁筛选法培养、纯化epcs与bmscs；免疫细胞化学法（cd34/cd133/cd44）分别鉴定两种细胞。结扎大鼠左冠状动脉，制作大鼠ami模型，42只大鼠随机分为假手术组，模型组，bmscs组，epcs+bmscs组，其中治疗组用丹酚酸b最佳药物浓度处理的epcs与bmscs混合，在大鼠ami区周边分五点注射。rtpcr检测心肌分化早期基因nkx2.5、gata4表达。结果 细胞移植4 w后，epcs+bmscs组心肌nkx2.5、gata4表达量分别为2.256±0.524和1.567±0.287，与对照组比较差异显著。结论 丹酚酸b预处理的epcs联合bmscs的移植上调了bmscs向心肌分化过程中nkx2.5、gata4基因的表达，对心肌细胞的数量增加有重要影响，从而有可能改善心功能。
【关键词】 丹酚酸b；急性心肌梗死；内皮祖细胞；骨髓间充质干细胞；细胞移植
effect of endothelial progenitor cells preconditioned with salvianolic acid b on early period gene expression of bone mesenchymal stem cells differentiation towards myocardial cells
li qingwen, tan junzhen, nan yayun, et al.
department of health & exercise science, tianjin institute of physical education, tianjin 300381, china
【abstract】 objective to investigate the effect of salvianolic acid b preconditioned endothelial progenitor cells combined with bone mesenchymal stem cells on gene expression in rats′ models of acute myocardial infarction(ami). methods cultivation and purification of epcs and bmscs in vitro were by densitygradient centrifugation and plastic adherence method, and were identified by immunofluorescence and immunocytochemistry (cd34/cd133/cd44). the rat model of ami was produced by ligation of the coronary artery. 42 rats were divided randomly by model, sham, bmscs and epcs combined with bmscs groups, and epcs preconditioned with salvianolic acid b combined with bmscs were injected into the five points of heart ischemia area. after 4 weeks, the expression of nkx2.5, gata4 were examined by realtime pcr. results the expression of nkx2.5 and gata4mrna were 1.700±0.382 and 1.135±0.257 respectively, which increased remarkably compared with control group. conclusions the epcs preconditioned with salvianolic acid b combined with bmscs transplantation can increase the expression of nkx2.5 and gata4, which improve the cardiac function.
【key words】 salvianolic acid b (salb); endothelial progenitor cells (epcs); bone mesenchymal stem cells (bmscs); acute myocardialin infarction (ami)
移植的干细胞能在受损心肌部位分化成为新的心肌样细胞〔1，2〕，而骨髓间充质干细胞（bmscs）因自体来源，取材容易，扩增能力强，成为研究热点。WWW.11665.coM目前研究主要集中在通过药物诱导来提高间充质干细胞（mscs）移植后的存活和定向分化〔3，4〕。本文前期的研究结果表明丹酚酸b(salb)可以减小心肌梗死的面积〔5〕,促进心脏功能的恢复。内皮祖细胞(epcs)是血管内皮的前体细胞，移植后促进缺血性疾病的血管再生和侧支循环建立已被证明〔6〕。因此本文采用salb预处理epcs，与bmscs联合移植，观察急性心肌梗死（ami）大鼠模型bmscs向心肌细胞分化过程中早期基因nkx2.5、gata4的表达情况。
1 资料与方法
1.1 材料 ldmem (美国gibco公司)；特级胎牛血清（美国hyclone公司）；血管内皮生长因子（vegf）,碱性成纤维细胞生长因子（bfgf），纤维连接蛋白(r＆d公司)；大鼠单个核细胞分离液（天津灏洋）；5％co2恒温培养箱（model tc2323 co2 incubator）；cd34兔多克隆抗体，cd44兔多克隆抗体(武汉博士德），cd133兔多克隆抗体（天津灏洋）；salb（天津天士力现代中药资源有限公司，批号20060601）；abi7300实时定量pcr仪；逆转录试剂盒、sybr(r) premix ex taqtm（宝生物工程（大连）有限公司）；trizol总rna提取试剂（天津润泰科技发展有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 epcs培养与鉴定 贴壁培养和密度梯度离心结合法：雄性wistar大鼠，脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，dhank液冲洗骨髓，筛网过滤，将大鼠单个核细胞分离液（密度为1.080 g/ml）预先置于试管的底部，按照1∶1的比例缓慢滴加骨髓悬液，离心（2 000 r/min，15 min），抽取位于界面层灰白色的单个核细胞，用dhank离心洗涤后，以2.0×105/cm2的密度接种于纤维连接蛋白(5 μg/cm2)的包被的培养瓶中，ldmem（含体积分数为15%胎牛血清，15%vegf，15% bfgf），置于37℃，5% co2饱和湿度的培养箱中培养，4 d后首次换液，继续培养至第7天。选取生长良好的培养至7 d的epcs，用sabc法检测细胞表面抗原cd34、cd133。cd34、cd133定位于细胞膜及细胞质。以细胞膜和细胞质出现棕黄色、高出背景色者为阳性细胞。
1.2.2 bmscs培养与鉴定 贴壁培养和密度梯度离心结合法：雄性wistar大鼠，脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，dhank液冲洗骨髓，筛网过滤，将percoll细胞分离液（密度1.073 g/ml）预先置于试管的底部，按照1∶1的比例缓慢滴加骨髓悬液，离心（1 800 r/min，20 min），收获位于界面层灰白色的单个核细胞，用dmem离心洗涤后以3.0×105/cm2的密度接种于dmem（含10%胎牛血清），置于37℃，5% co2饱和湿度的培养箱中继续培养，48 h后首次换液，以后每3 d更换一次培养液。2 w后，细胞长满80%瓶底。bmscs表达cd44，但不表达cd34。
1.2.3 mtt方法检测salb的最佳药物浓度 设立salb浓度为0，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32，64 μg/ml共10组，mtt方法分别测定细胞的吸光度（od）值，根据od值均数确定salb的最佳药物浓度。
1.2.4 大鼠ami模型的制作 冠状动脉结扎法，乙醚麻醉后将大鼠固定于手术台，颈部胸部备皮、消毒，铺无菌孔巾，在胸部左侧约0.5 cm处第4、5肋间切开皮肤，剪开心包，暴露心脏，以左冠状动脉主干为标志，在左心耳根部下方2 mm结扎左冠状动脉。标准肢体导联记录心电图。术后15 min心电图t波高尖、st段显著抬高标志结扎成功。
1.2.5 实验动物分组 42只清洁级雄性wistar大鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk20050001）。体重230～270 g，心梗造模成功后，随机分为假手术组，模型组，bmscs组，epcs+bmscs组。其中假手术组，只开胸穿线，不结扎左冠状动脉；模型组开胸结扎左冠状动脉，注射细胞培养液。bmscs组注射正常培养的bmscs 500 μl，epcs+bmscs组salb预处理epcs后与bmscs混合注射。
1.2.6 细胞移植 获取细胞混悬液，调整细胞浓度：bmscs浓度为1×107/ml；salb最佳药物浓度处理的epcs浓度分别调整成1×105。治疗组手术结扎冠状动15 min后，再次打开胸腔，暴露心脏，用结核菌素注射器分别吸取250 μl bmscs细胞悬液和250 μl salb预处理的epcs细胞悬液（bmscs组只吸取500 μl bmscs细胞悬液），分别于结扎区附近心肌组织分5点注射细胞，模型组注射同剂量细胞培养液。
1.2.7 bmscs心肌nkx2.5、gata4基因表达的检测 4 w后，各组大鼠脱颈处死，迅速取心脏组织，置于液氮-70℃冰箱保存，检测组织mrna的表达。rtpcr法。
1.3 统计学分析 数据以x±s表示，spss11.5统计软件，采用单因素方差进行组间比较。
2 结果
2.1 salb最佳药物浓度确定 0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/ml各组细胞的od值均值分别为0.165±0.0300、181±0.016、0.178±0.032、0.169±0.020、0.173±0.023、0.184±0.030、0.205±0.050、0.178±0.043、0.175±0.029、0.169±0.032。其中，8 μg/ml组吸光度值与其他组比较差异有统计学意义，确定为salb最佳药物浓度。
2.2 salb干预epcs与bmscs移植对ami大鼠心肌分化基因表达的影响 与模型组相比，各细胞移植组nkx 2.5 mrna表达明显增加(p＜0.05，p＜0.01)；和bmscs组比较，epcs+bmscs组nkx 2.5 mrna表达明显增加（p＜0.05）；与模型组相比，各细胞移植组gata4 mrna表达明显增加（p＜0.05）。见表1。
表1 各组nkx2.5、gata4mrna相对表达量的比较（略）
与模型组比较：1）p＜0.05；与epcs+bmscs组比较：2）p＜0.05
3 讨论
ami后心功能不全是致死和致残的主要原因，其本质是心肌细胞的坏死。减少心肌细胞死亡的数量，补充再生的心肌细胞到坏死区域，是减少心室重塑，改善心脏功能的关键。一般认为成熟的心肌细胞是终末分化细胞，缺乏再生能力。bmscs是一种具有向多胚层组织分化的干细胞特性〔7〕，可分化为心肌细胞，随着mscs分离、培养和纯化技术的不断发展和成熟，如何提高细胞移植后bmscs存活和向心肌细胞定向分化成为研究的目标之一。本研究在前期研究基础上，用中药单体干预具有血管源性的epcs与bmscs联合移植，从改善bmscs微环境入手，提高其存活率和分化率。
丹参是活血化淤中药，具有祛淤止痛、活血通经等功效。丹参的化学成分主要分为脂溶性和水溶性两类。其水溶性成分均具有酚酸性结构，其中salb作为丹参中的主要水溶性成分，具有很强的抗脂质过氧化和清除自由基作用，在治疗心血管疾病等方面发挥着重要作用。
bmscs植入心肌组织后，心肌微环境是其定向分化的决定因素，分化信号提供给bmscs后，引起调控bmscs分化的关键基因表达的改变，bmscs在心肌微环境的诱导下能分化为具有功能的心肌细胞〔8〕。目前已发现的与心脏发育相关的基因有很多，本文选择了比较公认和研究较多的心肌早期分化基因nkx 2.5、gata4进行研究。nkx 2.5、gata4是对心脏早期发育具有至关重要作用的转录因子。nkx 2.5基因在心脏中特异表达，在胚胎、胎儿心肌细胞中保持一定的表达水平，是心脏前体细胞分化的最早期标志之一。gata4作为gata转录因子家族成员，在心脏中特异性表达，最初表达于原始心肌中层，然后在血管和心脏内膜及肌层中表达，它除了直接参与调节心肌细胞结构基因和相关调控基因的表达外，还可与几种心肌基因调控区的dna结合，参与心肌细胞的分化过程。抑制gata4的生成，或应用rna干扰技术可使心肌细胞分化受阻。nkx 2.5、gata4在心肌细胞发育的早期即出现表达，两者单独或协同作用可促进正常心肌细胞的特化、分化和成熟。
本实验结果表明，用salb预处理epcs与bmscs联合移植治疗急性心肌梗死，两种细胞联合移植显著上调nkx 2.5、gata4的表达，表明salb能增加epcs增值、黏附、迁移能力，通过促血管新生，改善心肌微环境，上调心肌细胞早期基因的表达，从而提高了bmscs向心肌细胞的定向分化，可能成为改善心功能的机制之一。
【参考文献】
1 cogle cr，yachnis at，laywell ed,et al.bone marrow transdifferentiation in brain after transplantation:a retrospective study〔j〕.lancet,2004；363(9419):14327.
2 schmidt a，ladage d，steingen c,et al.mesenchymal stem cells transmigrate over the endothelial barrier〔j〕.eur cell biol，2006;85(11)：117988.
3 葛均波.我国干细胞治疗心脏病临床研究现状与展望〔j〕.中华心血管病杂志,2006；34(2):978.
4 陈新云，曾 智，饶 莉，等.心脏营养素1对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的作用〔j〕.四川大学学报(医学版)，2009;40(1):858.
5 范英昌,赵桂峰,张文治.丹酚酸b对大鼠心肌梗死过程中病理形态学的影响〔j〕.天津中医学院学报，2004;23(1):124.
6 tokcaerkeskin z，akar ar，ayaloglubutun f,et al.timing of induction of cardiomyocyte differentiation for in vitro cultured mesenchymal stem cells：a perspective for emergencies〔j〕.can j physiol pharmacol，2009;87(2):14350.
7 mangi aa,noiseux n,kong d,et al.mesenchymal stem cells modified with akt prevent remodeling and restore performance of infracted hearts〔j〕.nat med,2003;9（9）:1195201.
8 张荣莉，姜尔烈，王 玫，等.骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养诱导分化为心肌样细胞〔j〕.中国实验血液学杂志，2008;16(5):11115.
