【摘要】 目的 观察大鼠肾小球系膜细胞随增龄细胞表型及功能的变化特点。 方法 取3、12、24月龄健康雄性wistar大鼠原代系膜细胞进行培养，mtt法检测细胞增殖能力，进行saβgal染色，采用rtpcr和western印迹法分别检测p21waf1/cip1/sdi1基因及蛋白质的表达变化，并用免疫荧光法检测系膜细胞中p21waf1/cip1/sdi1的表达与定位。 结果 大鼠肾小球系膜细胞增殖能力随增龄逐渐减弱(p<0.05)，saβgal染色阳性率随增龄逐渐增加(p<0.05)，p21waf1/cip1/sdi1 mrna及蛋白质表达随增龄逐渐增加(p<0.05)。免疫荧光结果示p21waf1/cip1/sdi1主要在细胞核内表达，荧光强度随增龄逐渐增强 (p<0.05)。 结论 大鼠肾小球系膜细胞随增龄细胞形态、增殖能力与衰老相关蛋白表达发生明显改变，出现了复制性衰老表型。
【关键词】 系膜细胞；衰老；细胞表型；p21waf1/cip1/sdi1
the characteristic and significance of rat mesangial cells with advancing age
zhuo li, cai guangyan, liu fuyou, et al.
department of nephrology, kidney institute & key lab of pla, chinese general hospital of pla, beijing 100853, china
【abstract】 objective to investigate the characteristic of rat mesangial cells with advancing age. methods male wistar rats aged of 3, 12, 24 months were used. the rat mesangial cells were processed for mtt assay and senescence associated βgalactosidase (saβgal) staining. the expression and location of p21waf1/cip1/sdi1 in mesangial cells were studied by immunofluorescence. the mrna and protein levels of p21waf1/cip1/sdi1 were detected by western blot and/or rtpcr, respectively. results the ability of proliferation was decreased in rat mesangial cells with advancing age(p＜0.05).the expression of senescence associated βgalactosidase activity was increased in mesangial cells with advancing age. percentages of saβgal staining positive cells were (11.9±3.6)% versus (39.0±4.0)% versus (86.9±7.4)% (p＜0.05) in young, middle and aging glomerular mesangial cells. the p21waf1/cip1/sdi1 protein showed localization in nucleus in mesangial cells, and the staining intensity of p21waf1/cip1/sdi1 in mesangial cells in old animals was markedly increased, as compared to that in young and middle age rats (p＜0.05).the mrna levels of p21waf1/cip1/sdi1 was significantly increased in mesangial cells in old animals, as compared to that at the age of 3 and 12 months, meanwhile the p21waf1/cip1/sdi1 proteins expression were dramatically increased with advancing age (p＜0.05). conclusions the cellular phenotype and function are changed in rat mesangial cells with advancing age. the rat mesangial cells appear replicative senescence with advancing age.
【key words】 mesangial cells; senescence; phenotype；p21waf1/cip1/sdi1
多数学者认为，器官衰老是由于其固有细胞功能减退所导致，肾小球系膜细胞作为肾脏最重要的固有细胞之一，具有调节肾血流量，分泌细胞外基质、炎症介质等功能，其表型和功能的改变在肾脏衰老进程中必然发挥着重要的作用。WwW.11665.Com为了能客观真实地反映肾小球系膜细胞随衰老的变化，排除体外培养环境对细胞表型的影响，本研究应用自然衰老的24月龄大鼠，体外培养原代的肾小球系膜细胞，观察系膜细胞是否随机体增龄而衰老，以及老年大鼠系膜细胞p21waf1/cip1/sdi1表达的变化，为进一步研究系膜细胞衰老的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 原代大鼠系膜细胞培养 不同鼠龄雄性wistar大鼠〔解放军总医院实验动物中心提供，scxk(京)20050013〕15只，分3月龄组、12月龄组及24月龄组，每组各5只，无菌条件下取双侧肾脏，剥离肾包膜，用剪刀把肾皮质剪成碎块，放于重叠的3层不锈钢筛网上研磨，镜下观察，若见98%以上的肾小球脱去包曼氏囊，视野中基本上无肾小管存在，即可停止冲洗。收集第2层筛网上的组织移入离心管，v型胶原酶消化后，应用15％胎牛血清的rpmi 1640培养液，37℃、5％co2条件下培养原代的系膜细胞，约7 d后第1次传代，传代的细胞24 h全部贴壁，生长迅速，形态为梭形或不规则星形，3～4 d已汇合成片，纯度极高，经鉴定结蛋白(desmin)阳性、抗ⅷ因子抗体阴性，传至第3代，用于实验。
1.2 四甲基偶氮唑盐（mtt）法检测细胞增殖能力 系膜细胞生长至80％融合，0.25％胰酶消化，计数后接种于96孔板，2 000个细胞/孔，细胞贴壁后，继续培养24、48、72、96、120 h，加入mtt(5 mg/ml)10 μl 孵育4 h后，加二甲基亚矾（dmso）200 μl/孔裂解细胞，避光10 min，于492 nm波长记录吸光度值。
1.3 衰老相关半乳糖苷酶活性（saβgal）染色 接种于6孔板中的各组细胞，待细胞生长至80％汇合，用磷酸盐缓冲液（pbs）清洗3次，于室温固定细胞5 min，pbs液清洗3次后，加上新配制的含1mg/ml 5溴4吲哚βd半乳糖苷（xgal）（美国progrma公司）的saβgal染液，置37℃（无co2）温育12～16 h，pbs液清洗3次后，观察细胞胞浆中蓝色沉淀，用数码相机拍照。
1.4 rna提取及反转录聚合酶链反应（rtpcr）分析 利用trizol一步法提取肾小球系膜细胞总rna，进行rtpcr。采用的引物序列如下：p21waf1/cip1/sdi1上游引物为：5′ ctg cca gct gcc cct cta ttt tg 3′，下游引物：5′ cat ctt ggc ctg gct cct tgt a 3′，产物片段大小为373 bp；选用大鼠甘油醛3磷酸脱氢酶（gapdh）为参照，上游引物：5′ tgc acc acc aac tgc tta gc3′，下游引物：5′ggc atg gac tgt ggt cat gag3′，产物片段大小为191bp(北京赛百盛公司合成)。反应条件为94℃(5 min)→［变性94℃(45 s)→58℃退火(45 s)→延伸72℃(45 s)］×30个循环→72℃(7 min)。用alphalmagertm 2200凝胶图像分析系统(美国alpha公司)，进行半定量分析。
1.5 蛋白质提取及western印迹 将收集的细胞加入200 μl预冷的蛋白抑制率(ripa)裂解液进行匀浆，4℃ 12 000／min离心25 min，吸取蛋白，经micro bca protein kit测蛋白浓度。取100 μg总蛋白，加2×十二烷基磷酸钠（sds）上样缓冲液，100℃变性 5 min。进行12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sdspage)分离，将胶中蛋白转印至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭4 h，加p21waf1/cip1/sdi1小鼠单克隆抗体(美国santa cruz公司产品)4℃过夜，二抗室温孵育1 h，tris缓冲液（tbst）洗后用化学发光显影(ecl)(美国santa cruz公司产品)显色。所得结果以βactin (美国santa cruz公司产品)为参照，用uvp2000 凝胶图像分析系统(美国基因公司)进行半定量分析。
1.6 大鼠原代系膜细胞间接免疫荧光染色 不同组细胞贴壁后，用3％多聚甲醛＋2%蔗糖37℃固定10 min，pbs洗3 遍，冰上透化10min，pbs洗3遍，1％牛血清白蛋白（bsa）冰上封闭10 min，p21waf1/cip1/sdi1小鼠单克隆抗体，37℃孵育1 h，4℃过夜，含吐温20的tbst洗10遍，tritc标记的山羊抗小鼠igg，避光室温孵育1 h，tbst洗10遍，荧光显微镜下照相。
1.7 统计学处理 使用spss11.0软件进行统计分析，计量资料使用x±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 不同月龄大鼠原代系膜细胞生长及表型特征 3、12及24月龄大鼠的原代系膜细胞均为长梭形或不规则星形，贴壁后生长迅速，约3～4 d后可传第1代。传代后，3、12月龄大鼠的系膜细胞仍保持旺盛的增殖能力，约2～3 d传1代，3月龄大鼠系膜细胞可传20代左右；而12月龄大鼠系膜细胞可传10代以上。24月龄大鼠的系膜细胞生长速度明显较3及12月龄大鼠系膜细胞减慢，约5～7 d才可传1代，群体倍增时间较前者系膜细胞延长1倍以上。而且传至第2～3代后，细胞肥大，形态变扁平、伸展，代谢减慢、生长停滞，失去增殖和传代能力。
2.2 不同月龄大鼠原代系膜细胞增殖能力 mtt法检测结果显示，24月龄大鼠系膜细胞72，96及120 h的od值（0.314±0.05，0.385±0.06及0.456±0.08）显著低于3月龄大鼠系膜细胞（0.430±0.03，0.556±0.04及0.671±0.05）及12月龄大鼠系膜细胞（0.425±0.04，0.543±0.05及0.657±0.06）相应时间点的od值（p＜0.05）；3月龄与12月龄间比较无统计学差异(p＞0.05)。
2.3 不同月龄大鼠原代系膜细胞saβgal染色 结果显示，3月龄大鼠的系膜细胞染色阳性率很低，仅为(11.9±3.6)%，系膜细胞saβgal染色阳性率随增龄逐渐增高，12月龄组为(39.0±4.0)%，而24月龄组细胞阳性率高达(86.9±7.4)%。3组间两两相比，差异有统计学意义（均p<0.05），表明大鼠的系膜细胞在机体内确实随年龄增长而发生衰老。
2.4 rtpcr检测原代系膜细胞p21waf1/cip1/sdi1 mrna的表达 rtpcr检测结果显示，3，12，24月龄大鼠原代系膜细胞p21waf1/cip1/sdi1 mrna的相对值分别为1±0.03，1.14±0.05，1.34±0.05，3组间两两相比，差异有统计学意义（p<0.05），p21waf1/cip1/sdi1 mrna的表达随增龄而增加。
2.5 western印迹检测原代系膜细胞p21waf1/cip1/sdi1蛋白质的表达 应用western印迹，进一步检测了p21waf1/cip1/sdi1的蛋白质表达水平随增龄出现的变化。结果显示与p21waf1/cip1/sdi1mrna的表达一致，3，12，24月龄大鼠原代系膜细胞p21waf1/cip1/sdi1蛋白质的表达随增龄增加(1±0.04 vs 1.22±0.04 vs 2.03±0.10)（p<0.05）。
2.6 不同月龄大鼠原代系膜细胞间接免疫荧光染色结果 p21waf1/cip1/sdi1主要在大鼠系膜细胞胞核内表达，随着年龄增长表达的荧光强度逐渐上升，3月龄组大鼠系膜细胞荧光较弱，12月龄组稍有增强，24月龄组表达非常强，各组间比较差异有统计学意义（p<0.05）。见图1。
图1 不同月龄大鼠原代系膜细胞p21waf1/cip1/sdi1免疫荧光染色结果(×200)（略）
3 讨论
衰老是遗传决定的自然演进过程，一切细胞均有内在的预定程序决定其寿命。正常细胞在体外培养时，其分裂次数存在“hayflick”极限，亦称最大分裂次数。这种正常细胞在体外分裂潜能受限制的现象即称为复制性衰老，而这一现象提示复制性衰老可能是生物体生命周期在细胞水平的重演。有关体内细胞是否存在复制性衰老，这一问题仍有争议，但大多数生物学家认为复制性衰老与生物体整体衰老相关，是体内衰老现象的一种体外反映。随着生物体年龄的增加，衰老细胞不断在体内积聚。体外细胞培养中的复制性衰老可以反映体内衰老发生的过程，其特征包括：不可逆地丧失增殖能力，出现细胞体积增大、胞体变平，功能上发生有选择的、特异改变，例如某些衰老基因表达的变化等。
肾脏衰老的发生机制是一个非常复杂的过程，有学者认为其固有细胞功能的减退是导致肾脏衰老的重要原因和体现；而肾小球系膜细胞作为肾脏最重要的固有细胞之一，具有调节肾血流量，分泌细胞外基质、炎症介质等功能，其表型和功能的改变在肾脏衰老进程中也发挥着重要的作用，故本研究应用自然衰老的24月龄大鼠，体外分离培养原代的肾小球系膜细胞，并与3、12月龄大鼠的系膜细胞进行对比研究，观察不同月龄的肾小球系膜细胞细胞表型、功能的改变及p21waf1/cip1/sdi1的表达情况。结果显示，24月龄大鼠的系膜细胞增殖能力明显低于3月及12月龄组，且出现肥大等形态改变；此外，细胞saβgal的阳性率明显高于3月龄及12月龄大鼠。
p21waf1/cip1/sdi1基因可能是人类可分裂细胞中控制衰老进程的主导基因之一，在衰老细胞中的表达量是增殖细胞中的10～20倍，p21waf1/cip1/sdi1mrna的增加与老化的表型及细胞增殖的丧失密切相关。当增殖细胞的生长因子去除或接触抑制时，p21waf1/cip1/sdi1基因的表达明显增加；再用血清刺激时，p21waf1/cip1/sdi1mrna水平在静止细胞中起初增加，随后在进入s期前降到较低水平。与此相比，衰老细胞中p21waf1/cip1/sdi1mrna水平并没有降低，表明该基因在维持衰老细胞表型中发挥重要作用〔2〕。众多研究皆表明，p21waf1/cip1/sdi1在衰老细胞中高表达，可作为细胞衰老的特征之一〔3，4〕。而在本研究中，亦发现p21waf1/cip1/sdi1在大鼠系膜细胞核内表达，且随着月龄的增加，其基因及蛋白质的表达也逐渐增强。故而，目前研究结果都表明伴随着增龄，大鼠系膜细胞确实逐渐出现了复制性衰老。
综上所述，大鼠系膜细胞随机体增龄出现衰老，其细胞的表型及功能都发生了相应的改变，这可能是肾脏器官衰老的重要体现和功能减退的发生原因之一。然而，细胞及器官衰老都是多因素综合作用的结果，其过程相当复杂，故有关肾脏衰老的发生机制仍需要更多及更加深入的研究。
【参考文献】
1 dimri gp，lee x，basile g，et al.a biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo 〔j〕.proc natl acad sci usa，1995；92（20）：93637.
2 chang bd，xuan y，broude ev，et al.role of p53 and p21waf1/cip1 in senescencelike terminal proliferation arrest induced in human tumor cells by chemotherapeutic drugs 〔j〕.oncogene，1999；18 (34)：480818.
3 zheng qh，ma lw，zhu wg，et al.p21waf1/cip1 plays a critical role in modulating senescence through changes of dna methylation 〔j〕.j cell biochem，2006；98(5)：123048.
4 huang y，corbley mj，tang z，et al.downregulation of p21waf1 promotes apoptosisin senescent human fibroblasts：involvement of retinoblastoma protein phosphorylation and delay of cellular aging 〔j〕.j cell physiol，2004；201(3):48391.
