【摘要】 目的：研究皖北地区汉族人群中间隙连接蛋白37(connexin 37)基因c1019t多态性与冠心病的相关性。方法：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（pcr-rflp）结合琼脂糖凝胶电泳检测技术分析106例冠心病患者（其中心绞痛57例，心肌梗塞49例，均经冠状动脉造影证实），和38例冠状动脉造影无明显异常者（对照组）的connexin37基因c1019t多态性位点基因型和等位基因频率分布，同时将冠心病组分为心绞痛和心肌梗塞两组分别与对照组相比较。结果：在心肌梗塞组与对照组的基因型和等位基因频率分布比较中，connexin37c1019t基因型(cc型、ct型和tt型)在心肌梗塞组中分布频率分别为49.0%，30.6%，20.4%，在对照组中为15.8%，42.1%，42.1%，有明显差异(p=0.004)；c等位基因（cc+ct）频率在两组中分别为（61.5%：40.7%，p=0.024）。在性别亚分组分析比较中，男性人群的cc基因型和c等位基因频率在心肌梗塞组中明显高于对照组(cc基因型：56.0%：16.7%,p=0.0014,c等位基因频率：66.7%：40.0%,p=0.043),而女性心肌梗塞组中未发现上述明显差异。另外在心绞痛组和对照组基因型、等位基因频率分析比较中也未发现差异有显著性。结论：皖北地区汉族男性的cc基因型和c等位基因可能与心肌梗塞发生有相关性。
【关键词】 冠状动脉疾病；连接蛋白类； 基因
relevance of connexin37 gene c1019t polymorphism and coronary artery disease in han population in anhui regionfeng wei wang hongju wang yindepartment of cardiology the first affiliated hospital bengbu medical school bengbu anhui 233000， chinaabstract：objective:to investigate the association between the connexin37 c1019t polymorphism and coronary artery disease （cad）in northern population of anhui province.methods:the polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism(pcr-rflp)and agarose gel electrophoresis technique were used to examine connexin 37 gene c1019t polymorphism between 106 cad patients (57 patients with angina and 49 patients with myocardial infarction，which were verified by coronary angiography) and 38 control group, the cad patients were divided into two group:the group with angina and the other group with myocardial infarction(mi) and to compare with control group respectively.results:the genotype frequencies of cc,ct,and tt in connexin37 c1019t polymorphism was 49.0%，30.6%，20.4% in mi, 15.8%，42.1%，42.1% in the controls respectively (p=0.004).the frequency of the c allele carries(cc+ct) was 61.5% in mi group and 40.7% in the control group(p=0.024).subsequent stratified analysis revealed that and c allele frequency in male mi group were significantly higher than those of control group (genotype of cc: 56.0% vs.16.7%,p=0.0014,frequency of c allele: 66.7% vs.40.0%,p=0.043),but there was not statistic difference in female mi group.in addition，there was not statistic difference between the angina group and the control group in genotype and allele frequency.conclusion:the cc genotype and c allele may be associated with myocardial infarction of male in anhui province.
key words：coronary artery disease; connexins; genes
近年来研究发现：间隙连接蛋白37（connexin 37）表达改变及其基因c1019t多态性与心血管疾病的发生发展有着密切的相关性[1，2]。WWW.11665.cOm因为基因多态性存在种族、地域等差异[3～5]，所以目前的研究结果存在着争议，同时少有将冠心病的分型考虑在内。本研究旨在观察皖北地区汉族人群connexin 37基因c1019t多态性的分布特征，分析其与冠心病常见分型（心绞痛和心肌梗塞）之间是否存在相关性，同时与近期国内外研究结果做一比较。
1 资料与方法
1.1 一般资料
入选研究对象共144例，为蚌埠医学院第一附属医院心内科就诊患者，根据冠脉造影结果分为心绞痛组、心肌梗塞组和对照组。心绞痛组患者57例，男28例，女29例，平均年龄（62.37±11.28）岁。心肌梗塞组患者49例，男25例，女24例，平均年龄（66.78±11.17）岁。均冠脉照影示：至少一支冠状动脉或其主要分支直径狭窄≥50％，其中心肌梗塞合并典型临床表现，特征性的心电图改变以及心肌坏死标记物阳性中的两项。对照组38例，男18例，女20例，平均年龄（56.97±10.36）岁，冠脉照影示：冠状动脉未见明显狭窄。研究对象为无血缘关系的皖北地区汉族人，除外肝、肾、血液、肿瘤疾病以及严重急慢性感染。
1.2 方法
（1）基因组提取dna：采集观察对象外周静脉血2ml，置于edta抗凝管中摇匀，使用dna全血抽提试剂盒（takara公司）提取基因组dna，于-20℃ 冰箱储存备用；（2）聚合酶链式反应（pcr）检测：基因组dna：①pcr引物：5′-ctggacccaccccctcagaatggccaaaga-3′和5′-aggaagccgtagtgcctggtgg-3′(大连宝生公司合成)；②扩增：25μl pcr反应体系中有pcr反应液12.5μl、dna模板1μl、引物各10pmol加去离子水至25μl。扩增反应在梯度pcr仪完成（biometra公司）。扩增参数：94℃预变性3min，94℃变性1min。60℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共30个循环，最后72℃延伸8 min。③观察结果：取扩增产物3μl，经2％琼脂糖凝胶电泳后，结合标志在紫外灯下观察扩增产物是否为目的片段；（3） 限制性片段长度多态性分析（rflp）： 取pcr产物10μl加入bufferb 2μl,drdi内切酶（mbi公司）2μl及去离子水16μl混匀，置于37℃恒温箱，进行酶解反应6 h。酶解产物经3％琼脂糖凝胶电泳结合标志对照，在紫外灯下观察结果，同时通过凝胶成像分析系统进行拍摄。
1.3 统计学分析
所有资料分析均由spss 13.0软件包完成。基因型和等位基因频率用基因计数法计算，研究对象与哈迪-温伯格（hardy-weinberg）平衡符合程度，组间基因型和等位基因频率比较用四格表x2检验和r×c例联表x2检验，计量资料用均数±标准差(±s)表示，组间数据比较用单因素方差分析。p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 研究对象的一般临床资料
心绞痛组和心肌梗塞组平均年龄以及吸烟所占比例均显著高于对照组（p<0.05）。各组性别比例、体重指数（bmi）、高血压病史、糖尿病史、及血脂生化指标（tc、tg）无显著差异（表1）。表1 各组临床资料比较（略）注：与对照组相比△p<0.05。
2.2 connexin37基因型和等位基因分布频率的组间比较
（1）connexin37基因型分析： connexin37基因c1019t多态性位点pcr扩增产物片段大小为275bp。经过drdi内切酶酶解后形成3种基因型：cc型（含有酶切位点的纯合子，酶解形成240bp和35bp的两个片段）、tt型（无酶切位点的纯合子，片段大小仍为275bp）、ct型（杂合子，形成35bp，240bp，275bp三个片段），图中1，2，3为ct型，4，5为tt型，6，7为cc型（图1）。
（2）对照组与心绞痛组connexin37基因型、等位基因频率分布比较：connexin37c1019t基因型（cc型，ct型、tt型）在对照组和心绞痛组中分布频率无显著差异（χ2=4.141，p=0.126）。c、t等位基因频率在上述两组中的对比亦无显著差异（χ2=1.607，p=0.205）。同时在两组的性别亚分组中间也未发现有显著差异（见表2）表2 对照组与心绞痛组connexin37基因型、等位基因频率比较（略）
（3）对照组和心肌梗塞（mi）组connexin37基因型和等位基因频率比较：connexin37c1019t基因型(cc型、ct型和tt型)在mi组中分布频率分别为40.0%，30.6%，20.4%，在对照组中为15.8%，42.1%，42.1%(p=0.004)。mi组的c等位基因（cc+ct）频率（61.5%）显著高于对照组（40.7%，p=0.024）。在性别亚分组分析比较中，男性人群的cc基因型和c等位基因频率在mi组中明显高于对照组(cc基因型：56.0%∶16.7%,p=0.0014,c等位基因频率：66.7%∶40.0%,p=0.043),而在女性中mi组与对照组比较未发现显著差异（表3）。表3 对照组与心肌梗塞组connexin37基因型、等位基因频率比较（略）注：与对照组比较△p<0.05。
3 讨 论
在脉管系统中半通道由4种间隙连接蛋白组成，分别为connexin37、connexin40、connexin43、connexin45。[6]一些间隙连接蛋白广泛表达于各组织中，而另一些则较为严格地表达于特定组织中，并发挥着重要作用。间隙连接蛋白37（connexin37）就属于后者，它发现于脉管系统（如内皮细胞、平滑肌细胞）和炎症细胞中（如单核细胞、巨噬细胞）。研究发现，connexin37–/–载脂蛋白e（apoe）–/–基因敲除的小鼠与对照组connexin37＋/＋apoe–/–基因敲除的小鼠相比，前一种基因型更有利于动脉内膜粥样斑块的形成。这些观察结果提示了connexin37在apoe–/–的小鼠防止动脉粥样硬化（as）生成方面起到了保护性角色。同时还在小鼠实验中发现connexin37–/–小鼠表现出了明显的血管异常情况，如皮肤、胃肠、肺等组织的出血，显著的血管扩张，及充血等[7]。connexin37–/–小鼠中胶原和二磷酸腺苷（adp）诱导的血小板聚集反应与connexin37+/+小鼠相比也有所加强。另外，as的早期阶段，血单核细胞在趋化因子作用下募集到内皮损伤处，并穿过动脉内皮细胞到达动脉内膜，在内膜中单核细胞增殖、成熟、吸收脂质转变为泡沫细胞，形成as过程中的脂质条纹。wong cw和christen t等研究发现：祛除了connexin37的单核细胞/巨噬细胞与正常表达connexin37的上述细胞相比，其黏附于内皮细胞层的能力增强[8]。这一特性与细胞间atp的释放有关。细胞外atp的释放降低了正常表达connexin37的单核细胞/巨噬细胞的黏附性。相反，connexin37的祛除和connexin37半通道的阻滞减少了细胞外atp的释放，促进了单核细胞/巨噬细胞的黏附于基质。提示connexin37半通道释放atp，反过来atp又阻止了单核细胞的黏附。这些细胞黏附特性的改变有助于它们在as斑块处聚集，从而加快了as病变的进展。[9]综上所述表明，connexin37对于维持血管内皮结构和功能的完整性，防止血栓形成，抑制泡沫细胞形成这三方面有重要作用。而这三方面也与抑制as发生发展密切相关。
connexin37基因位于人类染色体1p35.1，全长2727bp，由两个外显子和一个内含子构成，编码333个氨基酸。研究发现，connexin37基因c1019t多态性位点是由于基因编码区1019位置的碱基发生突变（c→t)，导致编码的第319位氨基酸发生错义突变（脯氨酸→丝氨酸），直接影响了间隙连接蛋白三级结构的形成，同时由于编码氨基酸的不同，改变了connexin37蛋白原有的磷酸化位点，进而影响蛋白质的合成、转运、加工以及信号转导过程，从而影响血管内皮细胞的作用，导致人群对冠心病易感性的个体差异。1999年，boerma[10]等首次发现connexin37c等位基因频率在主动脉内膜增厚的瑞典男性人群中显著增高,揭开了connexin37基因c1019t多态性与as相关性的研究序幕。随后，yeh hl[3]等将这一基因多态性用于其他的as疾病中，如冠心病研究中，研究对象均来自台湾人，年龄与性别构成比相似。结果示：connexin37 t等位基因频率在对照组中是显著降低的，尤其是在男性患者中降低更为显著。提示c等位基因频率增高与冠心病的患病率相关。但是yamada及listi[11]分别在日本和西西里地区有关研究中发现男性冠心病的发生与connexin37t等位基因增高有关。冠心病的发病与遗传和环境因素有密切关系，本研究显示connexin37基因c1019t多态性不仅跟冠心病的发生有关，而且各型（心绞痛和心肌梗塞）之间以及性别上也存在着差异。男性心肌梗塞的发生与connexin37的cc基因型和c等位基因频率(cc+ct)增高有关，这一点与国内韩雅玲学者[12]的研究结果有相似之处。提示男女间冠心病的发生存在遗传学机制上的差异，同时也为该基因研究作为在冠心病群体中（尤其男性）筛查高危人群提供了可能依据。由于本研究中各组样本例数偏少，同时冠心病本身也是一种多因素的遗传疾病，单一致病因素可能在冠心病的发展中影响较小，connexin37基因c1019t多态性与冠心病之间的确切关系尚有待于大样本的进一步研究。
【参考文献】
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