【摘要】 目的: 研究 na+通道阻滞剂河豚毒素(ttx)停搏液对离体大鼠心肌粘合连接的 影响 . 方法 : wistar大鼠20只随机均分为ttx组和sth2（st. thomas2)组，建立离体心脏langendorff和neely灌注模型，待搏动稳定，灌注30 min后停搏60 min，再灌注60 min，观察各组心脏停搏前后心率（hr）、冠状动脉流量(caf)、左心室收缩末期压力(lvesp)以及压力变化速率(±dp/dt)的恢复率. 采用免疫组化和western blot检测大鼠心肌α肌动蛋白（αactin）的分布和量的变化；免疫组化检测n型钙粘蛋白（ncadherin）的分布及量的变化. 结果: ttx组和sth2组的停搏时间分别为（8.55±0.68） s和（9.49±0.49） s；复搏时间分别为（10.12±0.66） s和（10.88±0.61） s，与sth2组比较，ttx组的停搏时间和复搏时间均明显缩短 (p<0.01或p<0.05). 复搏后，ttx组和sth2组的hr， caf， lvesp， +dp/dt及-dp/dt的恢复率分别为（85.65±1.98）%，（91.81±2.29）%，（85.03±0.91）%，（93.59±2.22）%，（92.87±2.59）%和（77.66±1.56）%，（88.28±1.81）%，（82.24±0.82）%，（90.25±3.31）%，（88.36±4.65）%，ttx组的各项血流动力学参数恢复率均优于sth2组(p<0.01，p<0.05). 免疫组化显示ttx组和sth2组的n型钙粘蛋白和α肌动蛋白的表达量分别为0.06765±0.00027，0.07375±0.00049和0.02426±0.00025，0.03047±0.00017. western blot显示ttx组和sth2组的α肌动蛋白的表达量分别为864.8±6.5，347.0±7.5. 与ttx组比较，sth2组分布紊乱，量明显减少(p<0.01). 结论: 以ttx 阻断na+通道为特点的心脏停搏液对大鼠心肌缺血再灌注损伤时的粘合连接及心功能的保护作用优于sth2心脏停搏液.
【关键词】 ttx停搏液；河豚毒素；钙粘着糖蛋白类；肌动蛋白类；粘合连接
0引言
粘合连接是由钙粘蛋白通过纽蛋白和α辅肌动蛋白与胞质内肌动蛋白丝相连构成，是心肌细胞间最重要的连接结构之一［1］. 已有的研究［2-3］证实了以阻滞剂河豚毒素(tetrodotoxin, ttx)阻断na+通道为特点的心脏停搏液对心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury， miri）显示出一定的优势，有关的研究主要集中在对细胞器等方面，而对细胞粘合连接的研究还少见报道. 本实验旨在观察以ttx阻断na+通道为特点的心脏停搏液在miri中对粘合连接的影响，同时监测心功能的变化，以探讨其可能的机制.
1材料和方法
1.1材料成年wistar大鼠20只，雌雄不拘，体质量200～250 g（第三军医大学大坪 医院 实验动物中心）；ttx（泰州康特生物工程公司）；n型钙粘蛋白（ncadherin）一抗，α肌动蛋白（αactin）一抗，生物素标记的二抗及免疫组化试剂盒（武汉博士德公司）；辣根过氧化物酶标记的二抗（北京中杉公司）；bca蛋白浓度测定试剂盒，sdspage凝胶配制试剂盒，彩色预染蛋白分子量标准，pvdf膜（江苏碧云天公司）；ml870b2 langendorff离体心脏灌流系统（澳大利亚adinstruments公司）. krebshenseleit液（kh 液) (mmol/l) 成分：nacl 119，nahco3 25，kcl 4.75，mgso4 1.2，kh2po4 1.18，cacl2 1.4，glucose 11，42.41(mol/l) o2+2.23(mol/l) co2混合气持续氧合，维持ph 7.8（自行配制）；ttx心脏停搏液：质量浓度为20 μmol/l的ttx加入kh液中；sth2心脏停搏液成分(mmol/l)：nacl 110.0，kcl 16.0，mgcl2 16.0，cacl2 2.0，glucose 11.0,维持ph 7.8（自行配制）.
1.2方法
1.2.1实验分组将20只大鼠随机分为ttx组和sth2（st. thomas2)组，每组大鼠10只. ttx组采用ttx心脏停搏液停搏；sth2组采用sth2心脏停搏液停搏.
1.2.2实验模型的建立大鼠腹腔注射肝素盐水200 iu，20 min后脱颈处死，迅速取出心脏，建立离体鼠心langendorff和neely灌注模型. 用37℃, 42.41(mol/l) o2+2.23(mol/l) co2混合气持续氧合的kh液经主动脉根部逆行灌注，压力60 mmhg(1 mmhg=0.133 kpa)，稳定15 min. 左心房插管，左心室置入测压管，灌注液转流，转为工作心脏灌注模型，灌注压15 mmhg，后负荷52～60 mmhg，稳定5 min，测定心率（heart rate，hr）、冠状动脉流量（coronary artery flow, caf）、左心室收缩末期压（left ventricular end systolic pressure， lvesp）、左心室最大压力变化速率（maximal rise in left ventricular pressure/maximal fall in left ventricular pressure，±dp/dt. 工作15 min后，主动脉根部按2 ml/100 g质量注入4℃心脏停搏液使心脏停搏，并观察心脏停搏时间. 停搏30 min后再经主动脉根部按2 ml/100 g质量注入心脏停搏液停搏，停搏过程中同时给予4℃盐水纱布冷敷. 停搏60 min后给予37℃, 42.41(mol/l) o2+2.23(mol/l) co2混合气持续氧合的kh液经主动脉根部逆行复灌，观察心脏复搏时间. 15 min后转为工作心脏灌注模型，共复灌60 min，并在工作心灌注稳定后40 min测定血流动力学参数，血流动力学参数的恢复率用复搏后的参数除以停跳前的相应参数. 20 min后停止实验，取部分左心室肌50 mg，-80℃保存，用于心肌ncadherin和αactin的检测.
1.2.3心肌ncadherin和αactin的免疫组化检测取3 mm×3 mm×3 mm大小心肌组织行石蜡切片，sabc法行免疫组化染色，光学显微镜观察心肌ncadherin和αactin的分布情况并采集图像，采用imagepro plus 6.0图像 分析 系统进行半定量检测，用平均吸光度a值表示ncadherin和αactin的相对含量.
1.2.4心肌αactin的western blot检测取50 mg心肌组织，提取总蛋白，bca法定量，蛋白电泳分离、转膜、抗原抗体反应及ecl显色，采用quantity one图像分析系统采集图像并行半定量分析.
统计学处理：采用spss12.0软件进行统计学 分析 . 血流动力学参数测定采用多功能生理记录仪(adinstruments/8sp， australia)，chart 4图形、数据处理软件进行信号采集和统计. 数据以x±s表示，组间比较用两独立样本的t检验.
2结果
2.1停搏时间和复搏时间ttx组和sth2组的停搏时间分别为（8.55±0.68） s和（9.49±0.49） s；复搏时间分别为（10.12±0.66） s和（10.88±0.61） s，与sth2组比较，ttx组的停搏和复搏时间均明显缩短，差异均有统计学意义(停搏时间p<0.01，复搏时间p<0.05).
2.2血流动力学参数比较心脏停搏前，两组的血流动力学各项指标差异无统计学意义(p>0.05)；心脏复搏后40 min，ttx组的hr，caf,lvesp和±dp/dt恢复率明显优于sth2组，差异均有统计学意义(其中hr，caf,lvesp，p<0.01, ±dp/dt， p<0.05，表1).
表1再灌注期间两组血流动力学参数恢复率（略）
ap<0.05,bp<0.01 vs sth2.
2.3心肌组织中ncadherin和αactin的改变免疫组化结果显示，sth2组心肌组织中ncadherin和αactin分布紊乱，其表达量较ttx组明显减少. ttx组和sth2组的 ncadherin和αactin的表达量分别为0.06765±0.00027和0.07375±0.00049；0.02426±0.00025和0.03047±0.00017. western blot半定量分析结果显示ttx组和sth2组的αactin的表达量分别为864.8±6.5和347.0±7.5. sth2组与ttx组相比较，心肌组织中ncadherin和αactin表达量明显减少，差异具有统计学意义（p<0.05，图1，2）.
a: ttx组； b： sth2组； c: ttx组； d： sth2组.
图1心肌组织ncadherin，αactin的表达(免疫组化) ×400（略）
图2western blot检测心肌组织αactin的表达（略）
3讨论
ncadherin与αactin都是肌小节的标志物［1］，是心肌细胞维持正常结构，进行收缩的基础. kostetskii等［2］报道ncadherin基因的敲除导致了心肌细胞间粘合连接等连接结构的分解，该实验证实了ncadherin在维持心肌细胞间连接结构完整性方面的重要性.
心肌细胞和细胞间连接的结构与功能是紧密联系的，miri时二者相互 影响 . 膜片嵌实验证实缺血缺氧时心肌细胞的持续na+内流显著增加. ttx通过阻断持续的na+流对心肌产生保护作用［3］. ttx阻断na+通道作用直接且过程可逆，因此ttx对na+通道阻断更迅速，再灌注后na+通道功能恢复更快，停搏和复搏时间均明显短于sth2组，同时也减少了能量的消耗. ttx停搏液能迅速阻断na+通道，停搏后细胞内外离子浓度接近静息时的水平，从而使维持细胞离子内稳态的离子泵耗能降到最低限度，节省能量物质. 我们的前期 研究 也已证明ttx极化停博可明显减少心肌能量消耗［4］. 伴随着atp水解，αactin的稳定性随之降低；离子泵转运功能障碍，ca2+进入细胞激活ca2+依赖性蛋白酶，再灌注时，经一系列反应产生大量的超氧阴离子和过氧化氢；同时atp减少使ca2+进入线粒体增多，使线粒体功能受损，使氧自由基生成增多，清除减少，最终导致ncadherin和αactin的损伤. powell等［5］报道了缺血后收缩功能的失调是由于收缩蛋白氧化. ttx能够选择性阻断失活缓慢的na+电流，衰减na+窗口电流，减轻na+超载和ca2+超载，从而避免了对线粒体的损伤，增加了能量的供应；减轻了对自由基生成的促进作用；避免了对各种酶类的激活，其中由ca2+超载引起的钙蛋白酶激活可能具有重要作用［6］，因而有效地减轻了miri.
综上所述，ttx对心肌ncadherin和αactin的影响，对心肌粘合连接的其他结构，ncadherin与αactin之间的关系，ttx对心肌粘合连接的作用机制等尚需进一步研究.
【 参考 文献 】
［1］ bird sd, doevendans pa, van rooijen ma, et al. the human adult cardiomyocyte phenotype［j］. cardiovasc res， 2003，58(2):423-434.
［2］ kostetskii i, li j, xiong y， et al. induced deletion of the ncadherin gene in the heart leads to dissolution of the intercalated disc structure［j］. circ res，2005，96(3):346-354.
［3］ saint da. the role of the persistent na(+) current during cardiac ischemia and hypoxia［j］. j cardiovasc electrophysiol，2006，17(1):s96-s103.
［4］ 谭松涛，杨双强，杨朝坤. na+通道阻滞极化停搏液在离体大鼠心脏保存中的保护作用［j］. 第一军医大学学报，2005，25(10)：1283-1285.
［5］ powell sr, gurzenda em, wahezi se. actin is oxidized during myocardial ischemia［j］. free radic biol med，2001，30(10):1171-1176.
kim mj, oh sj, park sh, et al. hypoxiainduced cell death of hepg2 cells involves a necrotic cell death mediated by calpain［j］. apoptosis，2007，12(4):707-718.
