【摘要】 目的： 研究 紧密连接蛋白occludin，zo1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹中的表达. 方法 ： 成年健康杂色豚鼠，耳廓反射灵敏，分别取耳蜗、脑、肺三组组织，免疫组织化学法及western blot研究紧密连接蛋白occludin，zo1在耳蜗外侧壁血管纹中的表达，以脑组、肺组为阳性对照. 结果： 光镜下可见豚鼠耳蜗外侧壁血管纹毛细血管内皮细胞等边缘细胞中均强阳性颗粒表达，脑组、肺组毛细血管内皮细胞内壁也均有明显阳性表达；western blot下occludin, zo1在耳蜗组中高表达，并且明显高于脑组与肺组. 结论： occludin，zo1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹紧密连接中的高浓度表达，与维持血迷路屏障结构、功能密切相关.
【关键词】 occludin蛋白；zo1蛋白；连接蛋白类；耳蜗；血迷路屏障
0引言
血迷路屏障（blood labyrinth barrier, blb）的存在保证了内耳微环境的相对稳定，维持正常的内耳生理功能. 它主要由耳蜗外侧壁血管纹、螺旋韧带处连续无窗的毛细血管内皮细胞形成［1］. 血管纹是构成膜性蜗管外壁的重要组成部分，由毛细血管及边缘细胞、中间细胞、基底细胞构成. 毛细血管基膜菲薄，血管内皮细胞之间，边缘细胞之间和基底细胞之间均为紧密连接（tight junction, tjs）. tjs中最重要的是跨膜蛋白occludin与胞质附着蛋白zo家族（zonula occludens protein）及细胞内与其相连的细胞骨架蛋白. occludin及zo1的表达和分布与内皮细胞通透性密切相关. 但tjs蛋白在内耳血管纹中的研究鲜见报道，本研究对occludin及zo1在豚鼠耳蜗外侧壁血管纹的表达和分布进行初步研究，为进一步从分子角度研究血迷路屏障tjs作一铺垫.
1材料和方法
1.1材料健康成年杂色豚鼠30只，雌雄不限，耳廓反射灵敏，体质量250～350 g，由第四军医大学实验动物中心提供.
1.2方法
1.2.1免疫组织化学染色动物10 g/l戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，新鲜配置的40 g/l多聚甲醛灌注后断头，取出双耳听泡，刺开蜗尖及圆窗膜，灌注蜗尖数次，将耳蜗取出置入40 g/l多聚甲醛中，4℃中放置24 h后100 g/l edta脱钙14 d，同时取脑皮质及肺组织投入40 g/l多聚甲醛中24 h后700 ml/l乙醇室温保存. 石蜡包埋后沿蜗轴行平行切片, 切片厚度5 μm，取三种组织的三套石蜡切片分别进行antizo1，antioccludin和阴性对照染色切片，脱蜡、水化，pbs洗后分别加入一抗（zymed laboratories，美国），包括zo1兔多克隆抗体（1∶100）及occludin兔多克隆抗体（1∶100），4℃过夜；pbs洗；滴加羊抗兔二抗（sigma，美国，1∶200），37℃孵育2 h；滴加链霉素卵白素过氧化物酶（abc），37℃孵育1 h，pbs冲洗；dab显色，自来水冲洗，脱水，透明，封片，在光镜下观察. 阴性对照实验采用pbs代替一抗，其余步骤同上.
1.2.2western blot检测动物10 g/l戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉后迅速断头，取出双耳听泡，在体视显微镜下迅速取出耳蜗外侧壁血管纹，同时取出脑皮质及肺，western blot检测前这些组织均保存于-80℃冰箱. 实验分三组，耳蜗组，脑组和肺组. 蛋白质的提取：将三组蛋白分别匀浆，匀浆器中加入组织裂解液,包括20 mmol/l tris, ph 7.4, nacl, naf,焦磷酸钠，蔗糖，complete, mini, edtafree药片（roche diagnostics，德国），冰上充分匀浆，12 000 g，4℃，离心5 min，收集上清. 考马斯亮蓝检测三组蛋白的含量. 按照每泳道5 μg加载于sdspage凝胶电泳孔中，以恒压120 v/40 ma电泳至溴酚蓝到达凝胶底边. 恒流300 ma转印于nc膜上. 丽春红染色，tbst缓冲液配置的50 g/l脱脂奶粉室温下封闭2 h. 三组分别加入兔抗豚鼠zo1一抗（1 μg/ml），兔抗豚鼠occludin一抗（2 mg/l, zymed laboratories，美国）及兔抗actin（santa cruz,美国，1∶200），4℃过夜，tbst缓冲液洗膜2次，每次10 min，tbs缓冲液洗膜1次，10 min，加入hrp标记的二抗（北京中衫,1∶5000）,37℃孵育1 h，洗膜3次，每次10 min. ecl化学发光系统（pierce）检测occludin，zo1及βactin的蛋白表达水平. 分析 阳性条带的分子量大小，用tanon高清晰度 计算 机图像分析系统进行灰度扫描分析，根据信号的强弱分析蛋白的表达量. 以目的条带与βactin内参条带灰度的比值代表蛋白质表达水平.
统计学处理：数据均用x±s表示，采用spss 13.0统计软件， 应用 oneway anova方差分析法对两组以上的数据进行两两之间进行统计学检验.
2结果
2.1occludin,zo1在耳蜗外侧壁血管纹、脑皮质及肺组织中的免疫组织化学染色光学显微镜下，耳蜗外侧壁血管纹毛细血管内皮细胞、血管纹边缘细胞、基底细胞深染棕黄色阳性颗粒（图1a,2a），用pbs代替一抗时所有耳蜗细胞均未发现免疫信号（图1b，2b）；脑组中可见沿毛细血管内壁一周强阳性染色，在大血管中更为明显（图1c，2c）；肺组中（图1d，2d）见整张切片较强的阳性颗粒，主要表达在肺毛细血管内皮细胞.a：耳蜗外侧壁血管纹毛细血管内皮细胞、边缘细胞、基底细胞occludin阳性染色，b：为阴性对照；c：脑组中毛细血管内皮细胞occludin阳性染色；d：肺组中毛细血管内皮细胞occludin阳性染色.
图1occludin分别在耳蜗组、脑组和肺组中的免疫组织化学染色sabc ×400
a：耳蜗外侧壁血管纹毛细血管内皮细胞、边缘细胞、基底细胞zo1阳性染色；b：阴性对照；c：脑组中毛细血管内皮细胞zo1阳性染色；d：肺组中毛细血管内皮细胞zo1阳性染色.
图2zo1分别在耳蜗组、脑组和肺组中的免疫组织化学染色sabc ×400
2.2western blot结果采用occludin和zo1的抗体可分别识别出三种组织上这两种蛋白的表达，采用βactin作为内参，分别于mr 220 000，60 000，43 000出现阳性条带. 计算机灰度扫描软件分析灰度值（图3）.
3讨论
正常耳蜗微血管内皮细胞通透性对保证blb微环境的稳态具有决定性的意义. 耳蜗微血管内皮细胞在形态及结构上具有其特殊性：①具有大量的紧密连接；②大部分毛细血管内皮细胞为连续的无窗型内皮；③胞质内胞饮小泡少. 以上几点提示耳蜗微血管内皮细胞对于物质的通透具有选择性，维持内、外淋巴液的正常循环.
紧密连接（tjs）蛋白的高浓度表达是血管内皮细胞的结构特征及功能基础. tjs主要由跨膜蛋白和胞质附着蛋白组成. 跨膜蛋白occludin是第一个被发现的tjs蛋白［2］，序列 分析 其mr为60 000，仅在屏障内皮细胞高表达. 它含有四个跨膜区，相邻细胞通过外环以拉链形式相互结合从而产生细胞旁封闭. 其n端对tjs的装配和屏障功能的保持起重要作用; c端与zo1直接相连，与zo1共同调节紧密连接的结构变化，这一特点对occludin在tjs间的定位及细胞间的通透性调节非常重要［3］. tjs蛋白zo(zonula occludens proteins)是第一个被证实的tj附着蛋白，属于膜相关鸟氨酸激酶(maguk)家族，主要包括三个亚型，这一家族在胞质内有多个结合位点. zo与occludin的c端及claudins相互作用，将跨膜蛋白和细胞骨架连接在一起，并能识别tjs位置及传递各类信号. zo1 mr为220 000，它通过occludin位于胞质内的c2端直接相连［4］, zo1还可与肌动蛋白和jams蛋白相互作用，在细胞间tjs中起纽带作用. zo1可位于多种上皮细胞和内皮细胞的闭锁小带中，它可以敏感地反应出病理情况下屏障的损害，是检测内皮细胞屏障结构和功能的良好指标［5］. occludin和zo1的表达和分布与血管内皮细胞的通透性密切相关，其下调时血管的通透性增加，其上调时血管的通透性降低，渗漏减少［6-7］.
tjs蛋白的装配和改变涉及体内许多信号传导机制. 细胞间tjs调节所涉及的信号传导分子主要有rho gtp酶，ca2 + ，no，磷脂酶c，肌球蛋白轻链激酶(mlck)和蛋白激酶c (pkc)等. 这些信号通路可以通过改变肌动蛋白收缩性, 影响 细胞间tjs，使tjs蛋白如occludin和zo1磷酸化、去磷酸化,调节其通透性［ 8-10］.
本 研究 中，免疫组织化学染色后在光学显微镜下可见tjs蛋白occludin，zo1在耳蜗外侧壁血管纹明显表达，western blot检测分析中发现occludin，zo1在耳蜗组中的含量均明显高于脑组和肺组. 这说明tjs蛋白中最重要的occludin和zo1，在血迷路屏障的结构和功能维持中，与血脑屏障相似，起着不可替代的作用. blb也会因为内源性或外源性物质可激发某些信号传导通路，影响细胞间tjs，从而改变生理性屏障的功能，适应机体需要或诱发病理性损害，调节其对物质的通透性. 是否可以依据现阶段对于细胞间tjs及tjs蛋白的研究成果，对于血迷路屏障这一特殊领域进行深入研究，如在生理、病理条件下发生的屏障结构中tjs蛋白的微观改变；物质交换的信号机制及对内耳疾病进行旁细胞通路用药研究；研究tjs与听力的关系及药效评估等 问题 ，有待于进一步探索.
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