外源性结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成的作用
【摘要】 目的： 探讨外源性结缔组织生长因子（ctgf）在人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成中的作用. 方法： 将体外培养的人肾小管上皮细胞hk2分为三组：对照组；ctgf小剂量组（终浓度为2.5 μg/l）；ctgf大剂量组（终浓度为20 μg/l）. 用倒置显微镜观察细胞形态学变化；噻唑蓝（mtt）法检测细胞增殖活性；rtpcr检测hk2细胞e钙黏蛋白（ecadherin），α平滑肌肌动蛋白（αsma），纤连蛋白（fn）和胶原ⅰαmrna水平的变化；免疫组织化学方法观察hk2细胞fn和胶原ⅰ的表达. 结果： ctgf刺激使hk2 细胞由椭圆形变为梭形，同时促进hk2细胞增殖. 不同浓度的ctgf作用于hk2细胞48 h后，αsma 和fn mrna水平显著升高（p<0.05），e钙黏蛋白mrna的表达显著下降（p<0.05）；大剂量ctgf刺激hk2细胞48 h后胶原ⅰαmrna水平显著升高（p<0.05）. 小剂量ctgf组hk2 细胞胞质fn表达水平显著增加（p<0.05），大剂量ctgf组hk2细胞胞质表达fn和胶原ⅰ均显著增加（p<0.05）. 结论： ctgf在体外能够诱导人肾小管上皮细胞转分化，并促进fn的合成，大剂量的ctgf可以增加其胶原ⅰ的合成.
【关键词】 结缔组织生长因子；肾小管；上皮细胞；转分化；细胞外基质
大量证据表明，肾小管上皮细胞转分化为间充质细胞（epithelialmyofibroblast transdifferentiation, emt）是肾间质纤维化发生机制之一［1］. 结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, ctgf）是近年来发现与肾纤维化密切相关的细胞因子. 在新月体肾小球肾炎，iga肾病，局灶性节段性肾小球硬化以及糖尿病肾病的肾活检标本中发现ctgf表达增高，多种肾纤维化动物模型也证实存在ctgf表达上调［2］. 目前较多研究证实，ctgf作为转化生长因子β（tgfβ）的主要下游因子，参与了emt的发生与发展，但有关ctgf对肾小管上皮细胞直接作用的机制仍不十分明确. 本研究我们探讨外源性ctgf能否诱导人肾小管上皮细胞发生转分化及对细胞外基质合成的作用.
1材料和方法
1.1材料
细胞： 正常人肾小管上皮细胞（hk2）购自中国武汉典型培养物保藏中心. 主要试剂：重组人ctgf蛋白（rhctgf, peprotech），dmem/f12培养基，hepes(gibcol),胎牛血清（杭州四季青公司）；rna抽提试剂trizol（invitrogen），逆转录试剂盒（promega）,taq酶，dna maker(takara ),羊抗人胶原ⅰαpab（1∶200，santa cruz）,小鼠抗人fn mab（1∶200，neomarkers），hrp标记兔抗羊二抗，hrp标记兔抗小鼠二抗，（1∶200），dab显色液（武汉博士德公司）；mtt（美国sigma公司）；图像分析处理系统（美国uvp公司）；聚合酶链反应引物：均由invitrogen公司合成 (表1). 表1引物序列（略）
1.2方法
1.2.1细胞培养及分组将hk2细胞用含100 ml/l fbs的dmem/f12培养液传代培养，培养条件为37℃，50 ml/l co2 . 0.5 g/l胰酶＋0.2 g/l edta消化细胞后，1×108/l细胞接种于50 ml塑料培养瓶. 先以100 ml/l fbsdmem/f12培养细胞，70%～80％融合时改用无血清培养基培养24 h，使细胞生长同步化. 弃去培养液，将hk2细胞分为三组. 对照组：加无血清dmem/f12培养液；小剂量ctgf组：在无血清dmem/f12培养液中加入ctgf（终浓度为2.5 μg/l）；大剂量ctgf组：在无血清dmem/f12培养液中加入ctgf（终浓度为20 μg/l）. 每组设3个复瓶，作用48 h后收集细胞.
1.2.2hk2细胞形态学观察加入各组试剂后，每6 h在倒置显微镜下观察细胞形态变化，48 h后倒置显微镜下照相.
1.2.3mtt法将hk2细胞制成悬液，按1×108/l接种于96孔板中，细胞分组同前，每组设6个复孔，刺激48 h后mtt比色法测定细胞增殖，以每孔a490 nm处吸光度（a）值表示.
1.2.4rtpcr加入ctgf 48 h后，按照trizol说明书在培养瓶中提取总的rna，经紫外分光光度计鉴定，取总rna2 μg作逆转录，试验步骤参照逆转录试剂盒说明书进行. 取1 μl逆转录产物为模板，进行pcr扩增反应. gapdh 反应参数如下：预变性94℃ 5 min,变性94℃ 30 s，退火54℃. e钙黏蛋白（ecadherin）和纤连蛋白（fibronectin，fn）退火59℃，αsma和胶原ⅰα退火63℃, 40 s，延伸72℃ 30 s，28个循环（ecadherin，fn，αsma和胶原ⅰα 32个循环）后，72℃延伸7 min. 取pcr产物5 μl在10 g/l琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统成像后，用图像分析处理系统进行灰度扫描，以密度代表其表达量. 用gapdh量校正，计算出ecadherin，αsma，fn和胶原ⅰα的相对表达量［3］. 重复3次独立的rtpcr全过程.
1.2.5免疫组织化学细胞爬片制作： 将hk2细胞制成悬液，按1×108/l接种于置有波片的6孔板中，培养条件、细胞分组和处理方法同前，48 h后收集波片. 免疫组化染色：波片冰丙酮固定, triton x100孵育，0.3 ml/l双氧水孵育，兔血清37℃封闭，加一抗，二抗，sabc液孵育，最后dab显色，苏木素复染，pbs代替一抗做阴性对照. 结果判定： 以细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞，采用捷达病理图像分析软件分析，各组细胞爬片随机取6个视野，分别测定其平均吸光度（a）值.
统计学处理： 所有数据由spss 11.0统计软件进行分析，计量数据以x±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析，dunnet检验和非参数秩和检验. p<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1ctgf对hk2细胞形态的影响
倒置显微镜下观察结果显示，正常hk2 细胞为椭圆形贴壁细胞，培养液中加入ctgf（2.5 μg/l）48 h后，可见hk2细胞由椭圆形变为长梭形. 增加培养液中ctgf浓度（20 μg/l），细胞形态的梭形化更加明显.
2.2ctgf对hk2细胞增殖的影响
结果显示，每孔a490 nm处吸光度（a）值对照组为0.236±0.026；小剂量ctgf组为0.289±0.033；大剂量ctgf组为0.314±0.046. 与对照组比较结果显示，不同剂量ctgf均可促进细胞增殖（p<0.05）.
2.3ctgf对hk2细胞ecadherin和αsma mrna水平的影响
rtpcr结果显示，正常hk2细胞表达ecadherin，不表达αsma. ctgf（2.5, 20 μg/l）刺激48 h后，ecadherin mrna的表达较对照组下降（p<0.05），αsma mrna的表达较对照组提高（p<0.05，图1）.
2.4ctgf对hk2细胞fn和胶原ⅰαmrna水平的影响
rtpcr结果显示，正常hk2细胞少量表达fn和胶原ⅰα. ctgf（2.5, 20 μg/l）刺激48 h后，fn mrna的表达较对照组增加（p<0.05）. 小剂量ctgf组作用48 h后，胶原ⅰα mrna的表达较对照组无统计学意义（p>0.05）；大剂量ctgf组刺激48 h后，胶原ⅰα mrna的表达较对照组显著增加（p<0.05，图2）.
2.5ctgf对hk2细胞胞质fn和胶原ⅰ表达的影响
免疫组化结果显示，与对照组比较，小剂量的ctgf可以提高hk2细胞胞质fn的表达；增加ctgf的浓度，hk2细胞胞质fn的表达量增加更多（p<0.05）. 小剂量ctgf组作用48 h后，hk2细胞胞质胶原ⅰ的蛋白表达较对照组相比无统计学意义（p>0.05）；大剂量ctgf组刺激48 h后，hk2细胞胞质胶原 ⅰ 的蛋白表达较对照组增加（p<0.05，表2）. 表2ctgf对hk2细胞胞质fn和胶原ⅰ的表达(略）
3讨论
自strutz等［4］于1995年首先证实肾小管上皮细胞可以转化为间质细胞，以后称为emt，emt在肾间质纤维化中的作用日益受到人们的关注. 目前研究显示，有超过三分之一的肌成纤维细胞起源于肾小管上皮细胞［1］. emt主要包括四个关键步骤:上皮黏附特性消失，αsma表达和肌动蛋白重组，突破基底膜，细胞迁徙和侵袭增强［5］.
ecadherin是细胞间黏附蛋白，维持上皮细胞结构完整性和上皮极性，丧失ecadherin会引起上皮细胞间紧密连接消失，细胞失去极性. α sma 是平滑肌的标志蛋白,同时也是肌成纤维细胞的标志性蛋白,现被普遍用于检测肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的表型转化. 正常hk2 细胞表达ecadherin，不表达αsma. 肌成纤维细胞同时具有成纤维细胞和肌细胞的特性，表达αsma［6］. 我们的研究发现，ctgf能够使培养的正常hk2细胞发生形态学改变，细胞由椭圆变为长梭形，类似成纤维细胞形态. 提示细胞骨架构成发生改变. 研究也发现ctgf可以显著提高hk2细胞的增殖活性. rtpcr结果提示，对照组hk2细胞表达ecadherin，几乎不表达αsma. ctgf作用于正常hk2细胞，能够显著降低ecadherin mrna的表达，提高αsma mrna的表达. 这表明hk2细胞在ctgf作用下可能由上皮细胞表型向肌成纤维细胞表型发生转变.
细胞外基质在肾间质的过度沉积是引起肾间质纤维化的主要原因［7］. fn和ⅰ型胶原在间质的表达增多是肾间质纤维化的主要病理变化. ⅰ型胶原不仅作为ecm的重要组成部分，同时能够通过稳定间充质细胞的表型，进一步促进肾间质纤维化的发展. 本研究中我们发现，不同浓度的ctgf可以显著增加hk2细胞fn 基因的转录. 小剂量ctgf不能增加hk2细胞ⅰ型胶原基因的转录. 大剂量ctgf刺激hk2细胞，ⅰ型胶原基因的转录较对照组显著提高. 免疫组化结果也进一步证实ctgf可以提高hk2 细胞胞质fn蛋白的表达，大剂量ctgf能够增加hk2细胞胞质ⅰ型胶原蛋白的表达. qi等［8］在人近端小管上皮细胞，使用ctgf 20 μg/l刺激48 h，能够增加fn蛋白的表达，轻度增加ⅳ型胶原的表达. 张春等［9］的研究显示ctgf可以促进人近曲小管上皮细胞分泌fn. wang等［10］使用ctgf 1 μg/l刺激小鼠近端小管上皮细胞48 h，ⅰ型胶原的基因转录较对照组无显著变化. 这些研究与本实验结果相似. 我们研究发现ctgf 20 μg/l刺激hk2细胞48 h，可以增加ⅰ型胶原的表达，其与小剂量ctgf作用结果不同，考虑是由于ctgf剂量差异所致.
综上，ctgf可能通过诱导肾小管上皮细胞转分化，增加fn的合成，大剂量的ctgf可以增加其胶原ⅰ的合成，参与肾间质纤维化的发生发展. 因此阻断ctgf表达或者抑止其活性可能是更为有效的防治纤维化的手段.
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