作者：张裕强 朱华旭 郭立玮
【摘要】 ：目的 建立葛黄活血胶囊的质量控制标准。方法 建立黄芪、秦艽的薄层色谱鉴别方法和葛根素含量的高效液相色谱测定方法。结果 定性方法能检出黄芪和秦艽,且阴性对照无干扰；葛根素在0.020 79～0.665 2 mg/ml之间呈良好的线性关系,r＝1.000 0,平均加样回收率为100.1%,rsd＝0.92%。结论 该法操作简便、结果准确、重现性好,适用于葛黄活血胶囊的质量控制标准。
【关键词】 葛黄活血胶囊 薄层色谱法 高效液相色谱法 葛根素
abstract：objective to establish the quality control standards of gehuang huoxue capsules. methods tlc methods for identification of radix astragali and radix gentianae macrophyllae were established. a simple hplc method was established for the determination of puerarin. results the spots on tlc plates were clear without interference in the blank reference. the liner range of puerarin was 0.020 79～0.665 2 mg/ml, r＝1.000 0. the average recovery of puerarin was 100.1% and rsd＝0.92%. conclusion the method is simple, accurate, reproducible and can be used for the quality control standards of gehuang huoxue capsules.
key words：gehuang huoxue capsules；tlc；hplc；puerarin
葛黄活血胶囊由葛根、黄芪、当归、秦艽、丹参等8味中药组成,具有活血化瘀、理气止痛、疏通经络、调和经脉之功效。WWw.11665.COm用于治疗头痛眩晕、肢体麻木、心绞痛、高血压、高血脂等症。该方处于研制过程中。为了更好地控制其质量,保证该品的临床疗效,本研究采用薄层色谱法对方中黄芪、秦艽进行定性鉴别,采用高效液相色谱法对方中君药葛根进行定量研究。葛根具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻的功效,葛根素的含量较高,是葛根的主要有效成分。葛根素具有扩张冠脉、降血脂、抗血栓形成、调节血糖、改善脑微循环系统等作用,与本品的功能主治相一致,故将葛根素定为本品含量测定的指标性成分。文献报道的葛根素含量测定方法有高效液相色谱法[1]、分光光度法[2]等。本研究建立了本品制剂中葛根素的高效液相色谱测定法,方法可靠、灵敏、快速。
1 仪器与试药
采用美国agilent 1100 hplc系统,dad检测器,自动进样器,agilent色谱工作站。色谱柱：kromasil c18反相色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),中国科学院大连化学物理研究所制。
药材购于安徽省亳州市药材公司,经南京中医药大学中药鉴定教研室吴启南教授鉴定。秦艽为龙胆科植物秦艽gentiana macrophylla pall.、麻黄秦艽gentiana straminea maxim.、粗径秦艽gentiana crassicaulis duthie ex burk. 或小秦艽gentiana dahurica fisch.的干燥根,葛根为豆科植物野葛pueraria lobata(willd.) ohwi的干燥根。
葛根素对照品购自中国药品生物制品检定所,批号110752-
200209,供含量测定用。甲醇为色谱纯(江苏汉邦科技有限公司),水为重蒸馏水,其余试剂均为分析纯,硅胶g(青岛海洋化工有限公司)。葛黄活血胶囊(批号060817、060818、060819)由南京中医药大学中医药研究院提供。
2 定性鉴别
2.1 黄芪的薄层色谱鉴别[3]
取本品6粒,倾出内容物,研细,加水饱和的正丁醇120 ml,超声提取30 min,滤过,滤液用0.5%氢氧化钠溶液洗涤3次,每次50 ml,弃去下层碱液,上层正丁醇液用正丁醇饱和的水洗涤至中性,弃去水液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇2 ml溶解,作为供试品溶液。黄芪阴性制剂采用与制剂相同的处理方法。取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅵb]试验,吸取上述3种溶液各30、30、15 μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶g薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,日光下显相同的棕褐色斑点,紫外光灯(365 nm)下显相同的橙黄色荧光斑点,阴性在相同位置无此斑点存在。
2.2 秦艽的薄层色谱鉴别[4]
取本品6粒,倾出内容物,加适量浓氨水试液使之润湿,再加三氯甲烷40 ml,超声提取30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加三氯甲烷2 ml溶解,作为供试品溶液。取秦艽药材粉末3 g,加水80 ml,加热回流30 min,弃去水液,药渣加适量浓氨水试液使之润湿,再加三氯甲烷25 ml,超声提取30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加三氯甲烷5 ml溶解,作为对照药材溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅵb]试验,吸取上述2种溶液各7、3 μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶g薄层板上,以醋酸乙酯-甲醇(4∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的绿色荧光斑点,阴性在相同位置无此斑点存在。
3 含量测定
3.1 色谱条件[5]
色谱柱：kromasil c18反相柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸水(20∶80)；检测波长：250 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 ml/min；灵敏度：0.5 aufs；理论塔板数均在3 000以上。依照上述色谱条件测定,葛根素与其它组分均能达到基线分离。
3.2 对照品溶液的制备
精密称取于60 ℃干燥至恒重的葛根素对照品16.63 mg,置于25 ml容量瓶中,加流动相稀释至刻度,配成0.665 2 mg/ml的溶液,作为对照品溶液。
3.3 供试品溶液的制备
取本品装量差异项下的内容物,研细,取约0.25 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加30%乙醇25 ml,称定重量,超声处理(50 khz,250 w)10 min,放冷,称重,用30%乙醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液作为供试品溶液。
3.4 空白试验
原方去葛根药材,按制剂工艺法进行制备,得缺葛根的阴性制剂。取阴性制剂内容物0.25 g,按制剂供试液的制备方法制备阴性制剂供试液,依法分析,阴性制剂色谱图在葛根素相应保留时间位置无干扰峰,结果见图1。
3.5 线性关系考察
精密称取于60 ℃干燥至恒重的葛根素对照品16.63 mg,置于25 ml容量瓶中,加流动相稀释至刻度,制成葛根素标准贮备液(0.665 2 mg/ml)。分别配成0.332 6、0.166 3、0.083 15、0.041 58、0.020 79 mg/ml的系列对照品溶液,分别吸取上述溶液10 μl,注入液相色谱仪,测定。以峰面积为纵坐标,对照品浓度(mg/ml)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程：a＝38.133c＋0.889,r＝1.000 0。表明葛根素浓度在0.020 79～0.665 2 mg/ml之间呈良好的线性关系。
3.6 稳定性试验
同一样品(批号060817)供试液,隔2 h测1次,共测7次,结果表明,试供液中葛根素在12 h内稳定,其稳定性结果rsd＝0.23%。
3.7 精密度试验
同一样品(批号060817)供试液,依法测定,连续进样6次,测量值基本一致,其精密度结果rsd＝0.22%。
3.8 重复性试验
同一批号(批号060817)制剂,制备6份供试液,依法测定,重复性试验结果rsd＝1.25%,符合规定。
3.9 回收率试验
取已知含量的制剂(批号060817),进行加样回收率试验。取本品装量差异项下的内容物,研细,约0.13 g,共9份,精密称定,置锥形瓶中,加入浓度为0.332 5 mg/ml的标准品2.4、2.9、3.4 ml各3份,精密加30%乙醇使成25 ml,称定重量,超声处理(50 khz,250 w)10 min,放冷,称重,用30%乙醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液作为供试品溶液。依法测定,并计算葛根素回收率为99.68%,rsd＝0.38%,结果见表1。表1 加样回收率试验结果（略）
3.10 样品测定
取本品装量差异项下的内容物(批号060817、060818、060819),研细,取约0.25 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加30%乙醇25 ml,称定重量,超声处理(50 khz,250 w)10 min,放冷,称重,用30%乙醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,依法测定。以0.083 15 mg/ml葛根素对照品溶液进样测定,平均峰面积为3 175.85,根据外标一点法计算样品含量。结果见表2。表2 样品含量测定结果（略）
4 讨论
在供试品的处理方法实验中,对比了回流法和超声法2种提取方法,并比较了10、20、30 min不同超声时间。结果表明,超声法与回流法提取效果基本接近,但超声法操作简便,故选用超声法提取；超声提取时间对葛根素提取率基本无影响,故选用超声提取10 min。为了保证提取效果,超声时应稍振摇,使制剂样品在溶液中充分分散,防止结成团影响提取效果。
采用tlc法对制剂样品中秦艽进行鉴别时,尝试了以下3种展开剂：①氯仿-甲醇(5∶1)；②醋酸乙酯-甲醇(4∶1)；③乙醚-甲醇(4∶1)。结果显示,以醋酸乙酯-甲醇(4∶1)作为展开剂,斑点较清晰,分离效果好,重复性好,故选用该展开系统。
【参考文献】
[1] 张春晖,杨晓云,庞 清.高效液相色谱法测定芩莲葛根片中葛根素的含量[j].中国现代应用药学杂志,2004,21(5)：396－397.
[2] 刘逢芹,刘田云,李贵海,等.分光光度法和hplc法测定野葛藤总黄酮及葛根素的含量[j].中药材,2005,28(10)：895－896.
[3] 王春霞,李华康.补脾益肠丸中黄芪的薄层鉴别[j].时珍国医国药, 2000,11(3)：222.
[4] 周嘉琳,王永山.中药配方颗粒薄层色谱彩色图集[m].南京：江苏科学技术出版社,2004.113－114.
[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[s].北京：化学工业出版社,2005.233－234.
