作者：单娜,路金才,王晶,孙伟,杨惠

【摘要】  目的 测定辽宁不同产区朝鲜淫羊藿不同药用部位中淫羊藿苷及总黄酮的含量。方法 以淫羊藿苷为指标,采用高效液相色谱法测定淫羊藿苷的含量,紫外分光光度法测定总黄酮的含量。结果 叶中淫羊藿苷的含量在0.197%～0.347%范围内,茎中淫羊藿苷的含量在0.043%～0.050%范围内；叶中总黄酮的含量在6.68%～8.85%范围内,茎中总黄酮的含量在1.3%～2.7%范围内。淫羊藿苷在0.3～1.8 μg(r＝0.999 9)和0.5～3 μg/ml(r＝0.999 9)范围内线性关系良好。淫羊藿苷的平均回收率为99.43%(n＝6,rsd＝0.29%),总黄酮为100.38%(n＝9,rsd＝1.60%)。结论 辽宁不同地区的朝鲜淫羊藿有效成分含量不同,不同药用部位的总黄酮和淫羊藿苷含量差异较大,叶中的总黄酮和淫羊藿苷远高于茎。

【关键词】  朝鲜淫羊藿；总黄酮；淫羊藿苷；含量测定

    abstract：objective to determine the content of icariin and flavonids in epimedium koreanum nakai of different place of production and different pharmaceutical genetic in liaoning province. methods icariin was used as the chemical reference substance to establish hplc and ultraviolet spectrophotometry methods for content determination of icariin and total flavonoids. results the content of icariin in leaves was from 0.197% to 0.347%, and in stem was from 0.043% to 0.050%. the content of total flavonids in leaves was from 6.68% to 8.85%, and in stem was from 1.3% to 2.7%. the calibration curves of icariin was in good linearity over the range of 0.3～1.8 μg (r＝0.999 9) and total flavonids was 0.5～3 μg/ml (r＝0.999 9). the average recovery of icariin was 99.43% (n＝6, rsd＝0.29%) and total flavonids was 100.38% (n＝9, rsd＝1.60%). conclusions the content of flavonids in epimedium koreanum nakai of different place of production and different pharmaceutical genetic has large difference, the content in leaves is far higher than in stem.

    key words：epimedium koreanum nakai；total flavonids；icariin；content determination
 
    朝鲜淫羊藿(epimedium koreanum nakai)为小檗科淫羊藿属植物,系多年生宿根性草本,是淫羊藿的主要来源之一。WwW.11665.CoM朝鲜淫羊藿具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用,总黄酮是其主要成分,其中淫羊藿苷(icariin)是其主要活成分之一[1]。朝鲜淫羊藿主要分布于吉林省东部和辽宁省东部,黑龙江和吉林交界的地区也有少量分布。目前,关于辽宁产朝鲜淫羊藿的研究较少,为确定辽宁产朝鲜淫羊藿的最佳产地,我们对辽宁省4个主产地的朝鲜淫羊藿叶和茎中淫羊藿苷和总黄酮的含量分别进行测定,同时还与吉林通化产的朝鲜淫羊藿的有效成分予以比较。本试验采用高效液相色谱(hplc)法和紫外分光光度法[1]分别测定不同产地朝鲜淫羊藿叶和茎中总黄酮和淫羊藿苷的含量,以便为更好地利用朝鲜淫羊藿提供科学依据。

　　1  仪器与试药

    lab alliance-series ш型高效液相色谱仪,model 500型紫外检测器,alltech apollo c18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；uv-2600a型紫外分光光度计(龙尼柯上海仪器有限公司)；sarturius-bs124s分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)；kq·250tb型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
   
　　试验药材：辽宁宽甸(批号20070715)、辽宁本溪(批号20070710)、辽宁凤城(批号20070722)、辽宁新宾(批号20070718)和吉林通化(批号20070720)产地所有药材均由沈阳药科大学中药学院路金才副教授鉴定为朝鲜淫羊藿(epimedium koreanum nakai)。淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号110737-200413)。乙腈(色谱纯,山东禹王实业有限公司禹成化工厂),水为娃哈哈纯净水,其余试剂均为分析纯。

　　2  hplc法测定淫羊藿苷的含量

　　2.1  色谱条件与系统适用性试验

    色谱柱为alltech apollo c18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为乙腈-水(28∶72)；流速1.0 ml/min；检测波长270 nm；进样量10 μl；柱温为室温。理论塔板数按淫羊藿苷峰面积计算不低于1 500。

　　2.2  供试品溶液制备

    分别精密称取干燥的朝鲜淫羊藿叶、茎粉末(过3号筛)约0.2 g,精密称定,置50 ml量瓶中,加入稀乙醇20 ml,密塞称重,超声处理1 h,冷却至室温,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

　　2.3  对照品溶液制备

    精密称取淫羊藿苷对照品适量,加甲醇制成每1 ml含0.1 mg的溶液,即得。

　　2.4  方法学考察

　　2.4.1  精密度试验 

　　精密称取批号为20070715供试品溶液,按上述色谱条件测定,连续进样6次,记录淫羊藿苷的峰面积,计算相对标准偏差,结果rsd＝1.55%,表明色谱系统精密度
符合要求。

　　2.4.2  线性关系考察

　　取上述对照品溶液,精密吸取3、6、9、12、15、18 μl进样,按上述色谱条件测定。以进样量为横坐标,峰面积值为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程式：y＝2×109x＋1 375.2,r＝0.999 9。结果表明,淫羊藿苷在0.3～1.8 μg范围内进样量与色谱峰面积呈良好的线性关系。

　　2.4.3  稳定性试验 

　　精密称取批号为20070715样品,按上述色谱条件,分别在制备样品后的0、1、2、4、8、12 h测定。吸取10 μl注入高效液相色谱仪,记录淫羊藿苷的峰面积,计算相对标准偏差,结果rsd＝2.30%,表明供试品溶液在12 h内稳定。

　　2.4.4  重复性试验 

　　精密称取批号为20070715样品6份,每份0.2 g,精密称定,按“2.2”项下方法制备样品溶液,按上述色谱条件测定。记录淫羊藿苷的峰面积,计算相对标准偏差,结果rsd＝0.10%,表明方法的重现性良好。

　　2.4.5  加样回收率试验 

　　精密称取批号为20070715样品6份,各约0.1 g,分别精密加入淫羊藿苷对照品溶液(0.1 mg/ml) 3 ml,按“2.2”项下方法制备样品溶液,按上述色谱条件测定。记录淫羊藿苷的峰面积并计算其含量,平均回收率为99.43%, rsd＝0.29%(n＝6)。结果见表1。 表1  加样回收率测定结果（略）
 
　　2.4.6  样品测定

　　取不同产地朝鲜淫羊藿不同部位各0.2 g,精密称定,按“2.2”项下方法操作并按上述色谱条件进样分析,记录淫羊藿苷的峰面积并计算其含量,结果见图1、表3。

 
　　3  紫外分光光度法测定总黄酮含量

　　3.1  供试品溶液制备

    精密量取淫羊藿苷测定项下的供试品溶液0.5 ml,置50 ml容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为供试品溶液。

　　3.2  对照品溶液制备

    精密称取淫羊藿苷对照品适量,加甲醇制成每1 ml含10 μg的溶液,即得。

　　3.3  测定方法
   
　　以甲醇作为空白溶液,在270 nm波长处分别测定供试品溶液与对照品溶液的吸光度,计算,即得。

　　3.4  方法学考察

　　3.4.1  精密度试验 

　　精密称取批号为20070715样品,样品处理方法同“2.2”、“3.1”项,结果rsd＝0.24%,表明仪器精密度符合要求。

　　3.4.2  线性关系考察 

　　精密称取上述对照品溶液,精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml,置50 ml量瓶中,分别加甲醇稀释至刻度。按上述测定方法测定吸光度。以质量浓度为横坐标,吸光度的值为纵坐标绘制标准曲线,经计算得回归方程：y＝0.041 4x＋0.001 9,r＝0.999 9,结果表明,淫羊藿苷在0.5～3 μg/ml范围内吸光度与质量浓度之间呈良好的线性关系。

　　3.4.3  稳定性试验 

　　精密称取批号为20070715样品,按上述测定方法测定,分别在制备样品后的0、10、30、40、50、60 min测定吸光度,结果rsd＝0.57%,表明供试品溶液在1 h内稳定。

　　3.4.4  重复性试验 

　　精密称取批号为20070715样品6份,每份0.2 g,精密称定,按“2.2”、“3.1”项下方法制备供试品溶液,测定其吸光度,结果rsd＝1.36%,表明方法的重复性良好。

　　3.4.5  回收率试验
 
　　精密称取批号为20070715样品6份,各约0.1 g,分别精密加入淫羊藿苷对照品溶液(1 mg/ml)8 ml于量瓶中,按“2.2”、“3.1”项下方法制备样品溶液,按“3.3”项下方法测定,计算平均回收率为100.38%,rsd＝1.60%(n＝6),结果见表2。表2  回收率测定结果（略）

　　3.4.6  样品测定 

　　精密称取不同产地朝鲜淫羊藿的叶、茎各0.2 g,按“2.2”、“3.1”项下方法操作,并按“3.3”项下方法进行测定,记录吸光度并计算其含量,结果见表3。表3  不同产地朝鲜淫羊藿的叶、茎总黄酮和淫羊藿苷的含量（略）

　　4  讨论
   
　　本试验采用hplc法和紫外分光光度法对不同产地朝鲜淫羊藿不同部位的淫羊藿苷和总黄酮含量进行了测定,结果表明,不同产地朝鲜淫羊藿不同部位的总黄酮和淫羊藿苷含量差异较大,叶中总黄酮和淫羊藿苷远高于茎,但总黄酮含量高的地区淫羊藿苷的含量并不一定高；叶中含量高的茎中并不一定高。其中,叶中总黄酮含量最高的是宽甸地区,而茎中总黄酮含量最高的是新宾地区；叶中淫羊藿苷含量最高的是宽甸地区,而茎中淫羊藿苷含量最高的是凤城和新宾地区。由于朝鲜淫羊藿的最佳有效部位是叶,因此,辽宁省内朝鲜淫羊藿最佳产地是宽甸地区。

    本试验中朝鲜淫羊藿叶中总黄酮的含量达到了药典的标准(总黄酮＞5%),茎中总黄酮的含量未达到药典标准；而叶和茎中淫羊藿苷的含量均未达到药典标准(淫羊藿苷＞0.5%)。有文献报道,朝鲜淫羊藿中总黄酮和淫羊藿苷含量的高低主要受采收期的影响,其含量均以5月份花期为最高,但其生物量较小,所以,5月份并不是其最佳采收期,7月份以后含量则明显降低,总黄酮含量降至一半以下,而淫羊藿苷的含量甚至不足最高含量的1/3[2]；7、8月份吉林产的朝鲜淫羊藿中淫羊藿苷的含量也均未达到药典标准[3]。但目前朝鲜淫羊藿主要都是在夏秋季节采收,此时其药材生物量较高,因此我们这5个不同产地的药材统一选在7月中旬采收,总黄酮和淫羊藿苷的含量都有所降低,以至于淫羊藿苷的含量没有达到药典标准,但并不影响选择辽宁省内朝鲜淫羊藿的最佳产地。同时也提出一个问题,如果单独以淫羊藿苷含量为质量评价指标,传统采收时间所得药材的含量与药典的标准确实存在一定差距,需进一步的研究。

【参考文献】
  　　[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[s].北京：化学工业出版社,2005.229.

　　[2] 陈 萍,沙 明,杨松松.朝鲜淫羊藿中黄酮类成分在不同采收期限的含量变化[j].中国中药杂志,1996,21(2)：86－88.

　　[3] 齐晓丽,赵 露,王秀红,等.临江产朝鲜淫羊藿黄酮类化合物及淫羊藿苷积累动态研究[j].中药研究与信息,2005,7(12)：16－18.