作者：陈小睿，唐光曦，孟宪丽，黄雷雷，李佳川
【摘要】 目的 探讨中药复方制剂通脉醒脑滴丸防治脑缺血卒中可能的机理。 方法选用大鼠线栓阻断大脑中动脉法复制脑缺血再灌注模型，运用免疫组化方法，测定脑组织bcl-2、bax、cyt-c和caspase-3的表达，考察药物对caspase-3细胞凋亡通路的作用。结果通脉醒脑滴丸下调神经细胞的促凋亡基因bax、caspase-3和cytc表达。结论研究初步证实通脉醒脑滴丸对脑缺血损伤的保护作用，可能与负调caspase-3介导的细胞凋亡通路有关。
【关键词】 通脉醒脑滴丸; 脑缺血; 再灌注
脑缺血卒中作为临床常见的危重急症，一直备受关注。目前认为对脑缺血的治疗核心在于对神经元损伤的保护以及溶栓再通。是否能在脑缺血卒中发生后，尽可能延缓细胞凋亡组织坏死的进程，减轻神经元的损伤，是考察药物对脑缺血保护作用的要点。
本实验选用大鼠线栓法致局灶性脑缺血再灌注模型，采用免疫组织化学方法检测脑组织神经细胞bcl-2、bax、cyt-c、caspase-3的表达，探求药物是否可通过影响bcl-2或bax的表达，影响cyt-c在线粒体膜的聚集，进一步影响凋亡因子caspase-3的表达，发挥其对抗缺血脑组织损伤和神经细胞凋亡的作用。wWW.11665.Com
1 材料
1.1 药物受试药物：通脉醒脑滴丸，成都润华堂药业有限公司产品，批号：070530。规格：10 mg/粒。用法用量：口服，88粒/d，分4次服用。主治缺血性中风引起的半身不遂、口眼歪斜、言语不利、偏身麻木等。阳性对照药物：尼莫地平片，山西亚宝药业集团股份有限公司产品，批号：070109。规格：20 mg/片。用法用量：用于治疗缺血性脑血管病，口服，30～120mg/d。
1.2 试剂rabbit anti-caspase-3，北京博奥生物技术有限公司产品;cytochrome c(a-8)sc-13156，北京中杉金桥生物技术有限公司产品;bax(p-19)sc-526，北京中杉金桥生物技术有限公司产品;bcl-2 gm88702，基因有限公司产品;chemmate envision hrp鼠/兔 gk500705，基因有限公司产品;其它实验室常备试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器leica rm 2135石蜡切片机，德国;olympus-bx40型光学显微镜，日本olympus公司产品;mias2000型计算机图像工作系统，电子科大金盘多媒体科技有限公司产品;ld2-5医用离心机，北京医用离心机厂产品;wh-2型微量旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂产品;dhw-600型不锈钢电热恒温水箱，北京国华医疗器械厂产品;202-2型干燥箱，上海市实验仪器总厂产品。其它实验室常备器皿、耗材均为国产优质品。
1.4 动物 sd大鼠，spf级，质量(300±20)g，雌雄各半，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证号：scxk(川)2004-15。
2 方法
2.1 分组及给药选取健康sd大鼠18只，雌雄各半，随机将大鼠分为模型组、给药组、假手术组3组，每组6只。其中给药组给予通脉醒脑滴丸73.85 mg/kg;模型组和假手术组给予等体积蒸馏水。灌胃给药，1次/d，连续给药7 d。于第7天给药1 h后，假手术组大鼠仅在麻醉状态下分离右侧颈总动脉，不予阻断血流。模型组和给药组参照下述方法，复制线栓法致大鼠脑缺血再灌注模型。
参照文献方法[1～3]，第7天给药1 h后，腹腔注射10%水合氯醛3.5 ml/kg(350 mg/kg)将大鼠麻醉，分离右侧颈总动脉(cca)、颈外动脉(eca)和颈内动脉(ica)，在距cca分叉部4 mm处剪一小口，将拴线插入到ica，实现对大脑中动脉(mca)的阻断。固定线栓。逐层缝合切口并消毒。mca阻断2 h后，拔出线栓，进行再灌注。假手术组大鼠仅在麻醉状态下分离右侧颈总动脉，不予插入线栓阻断血流。
再灌注24 h后，各组大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，剪开胸壁，暴露心脏，将灌流装置的针头刺入左心室，止血钳固定，剪开右心耳，生理盐水250 ml快速灌流冲洗至肺叶和肝脏变白，换用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液250 ml灌注固定，30 min后断头取脑，置于4%多聚甲醛中低温避光固定24 h。心脏灌流前1h给药1次。
常规制备石蜡切片，he染色项下，采用dako envision显色系统，光镜100×视野下寻找海马结构，400×视野下，运用电子科技大学金盘科技有限公司mias2000型计算机图像工作系统，对染色结果进行检测，每张片选取不重叠的10个视野，每个视野选20个细胞，统计阳性表达的细胞数和阳性面积百分比。
2.2 统计方法运用spss 13.0统计软件进行统计分析。
3 结果
3.1 对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞bax表达的影响结果见表1。表1 对线栓法致脑缺血再灌注大鼠 脑组织神经细胞bax表达的影响(±s)
在高倍镜下，免疫组织化学染色结果显示：大鼠脑组织神经细胞bax蛋白主要在胞浆出现阳性表达。正常大鼠神经细胞bax有一定的阳性表达，而脑缺血再灌注大鼠的神经细胞表达则出现几乎满视野表达，染色呈棕黄或黄褐色。从表1可见，模型组大鼠脑组织神经细胞的bax表达较假手术组有明显的升高(p<0.01)。通脉醒脑滴丸组较之模型组，bax阳性细胞表达和阳性面积比明显降低(p<0.01)，提示通脉醒脑滴丸具有减少大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞bax表达的作用。
3.2 对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织细胞色素c(cyt-c)表达的影响表2 对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞cyt-c表达的影响(±s)
在高倍镜下，免疫组织化学染色结果显示，大鼠脑组织神经细胞cyt-c蛋白主要在胞浆出现阳性表达。正常大鼠神经细胞cyt-c的有一定阳性表达，而脑缺血再灌注大鼠的神经细胞表达则相对较高，染色呈棕黄或黄褐色。从表2可见，模型组大鼠脑组织神经细胞的cyt-c表达较假手术组有明显的升高(p<0.01)，给药组较之模型组，cyt-c阳性细胞表达个数和阳性面积比明显降低(p<0.01)，提示通脉醒脑滴丸具有减少大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞cyt-c表达的作用。
3.3 对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞caspase-3表达的影响结果见表3表3 对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞caspase-3表达的影响(±s)
高倍镜下，免疫组织化学染色结果显示，大鼠脑组织神经细胞caspase-3蛋白在胞浆和胞核均出现阳性表达。正常大鼠神经细胞caspase-3有一定阳性表达，而模型组大鼠几乎出现满视野的阳性表达，染色呈棕黄或黄褐色。从表3可见，模型组大鼠脑组织神经细胞的caspase-3表达较假手术组有明显的升高(p<0.01)。通脉醒脑滴丸组较之模型组，caspase-3阳性细胞表达和阳性面积比有所降低(p<0.05)，提示通脉醒脑滴丸具有减少大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞caspase-3表达的作用。
3.4 对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞bcl-2表达的影响在高倍镜下，免疫组织化学染色结果显示，正常组和给药组大鼠神经细胞bcl-2未见阳性表达，而脑缺血再灌注大鼠的神经细胞仅出现极少量表达，平均每100个细胞约有1个阳性细胞表达，染色呈黄褐色，分布在神经胶质细胞胞浆和胞膜。
4 讨论
由上实验结果可见，通脉醒脑滴丸能通过减少脑缺血再灌注大鼠脑组织bax的表达，引发线粒体内释放到胞浆的cyt-c相对于模型组明显减少，进一步导致caspase-3表达减少，发挥明显的抗凋亡作用。但我们的实验中，通脉醒脑滴丸组和假手术组未见bcl-2的阳性表达。
实验证明，通脉醒脑滴丸可通过减少脑组织bax的阳性表达，负调caspase-3介导的细胞凋亡的线粒体通路，保护缺血损伤的脑组织。
由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡(programmed cell death，pcd)。细胞内外的凋亡因素通过各种受体作用于细胞后，产生一系列复杂的生化反应，形成与凋亡相关的第二信使，继而通过胞内的信号转导途径激活后续凋亡程序。调控凋亡的基因接受由信号转导途径传来的死亡信号后，启动并合成执行凋亡所需的各种酶类和相关物质。继而由核酸内切酶和caspase执行死亡，前者破坏生命活动必须的所有指令，后者导致细胞结构的全面解体。
脑缺血损伤所致的细胞凋亡过程中，许多相关的细胞因子以及其它因素皆参与其中。如p53基因、早期即刻反应基因等，但目前认为，神经元凋亡最重要的调节者是caspase(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)家族和bcl-2家族[4]。
大量研究表明caspase家族在细胞凋亡机制中处于中心位置，而其中caspase-3处于caspase蛋白酶系的核心地位，通过切割多种不同的底物，导致蛋白酶系级联切割反应放大，最终诱导细胞走向死亡。
caspase的激活途径按照启动酶活性信号的起源分成线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路。而由细胞色素c(cyt-c)的释放介导的线粒体通路被广泛关注。研究证明，细胞色素c的释放与bcl-2家族成员密切相关。
bcl-2家族即b细胞淋巴瘤/白血病-2基因家族，被认为是与pcd密切相关的一组通道蛋白，主要位于线粒体、内质网和细胞核外膜。bcl-2家族包括抑制pcd发生的bcl-2、bcl-x1等以及促进细胞凋亡的bax和bcl-xs等。
bcl-2是细胞凋亡的重要抑制基因，定位于线粒体上，其功能是维持线粒体膜的完整性，控制着线粒体的深透转换(permeability transition)和离子、蛋白的外流，阻止线粒体膜整合蛋白的释放，尤其是细胞色素c的释放，而阻断caspase的激活，最终表现出凋亡抑制活性[5]。在脑缺血再灌注损伤中，bcl-2蛋白维持促凋亡成员在细胞内的定位分布，保护细胞不进入凋亡程序，同时控制细胞色素c的释放 [6]。
与bcl-2在凋亡进程中密切相关的bax基因，是bcl-2家族中第一个被确认有细胞凋亡促进作用的成员。bax主要位于胞质中，在凋亡信号诱导后很快迁移到线粒体，与线粒体膜结合，形成渗透性膜转移孔复合物，形成线粒体膜通道，将细胞凋亡的启动因子细胞色素c释放到胞质中，发动下一级的促凋亡反应。
研究发现，促凋亡蛋白bax通过促进电压依赖性阴离子通道vdac开放而诱导cyt-c从线粒体释放;抗凋亡蛋白bcl-2则通过与vdac直接结合而关闭vdac来阻止cyt-c释放[7]。
cyt-c是生物氧化的一个非常重要的电子传递体。正常情况下细胞色素c稳定性地结合于线粒体内膜，不能通过外膜。在受到凋亡信号的刺激后，细胞色素c通过线粒体膜的渗透性转移孔道释放出来，与凋亡促进因子-l(apaf-1)和caspase-9结合形成复合体，在atp参与下，使caspase蛋白酶家族发生酶解级联激活，主要通过caspase-3的激活造成基因组dna裂解，同时使dna修复相关酶失活，造成dna修复能力降低，以凋亡执行过程[8]。细胞色素c的胞外释放是脑缺血再灌注后线粒体凋亡通路中的关键的环节，应用激光共聚焦，放射免疫测定等实验方法，都证实了线粒体依赖性的凋亡通路中细胞色素c胞外释放这一环节[9]。
基于上述，本实验采用免疫组化的方法，检测了线栓法致大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后，诱导细胞凋亡的线粒体信号转导途径的重要通路因子bcl-2、bax、cyt-c、caspase-3的水平，以探究药物通脉醒脑滴丸是否能通过作用于该通路，减少凋亡相关因子的表达，发挥其脑保护作用。
结果显示通脉醒脑滴丸可明显减少caspase-3、cyt-c阳性细胞个数，且着色较浅。表明通脉醒脑滴丸可能通过减少cyt-c释放和下调caspase-3蛋白的表达而减少凋亡的产生，在线粒体途径所介导的细胞凋亡过程中发挥了脑保护作用。同时，与模型组比较，通脉醒脑滴丸组大鼠海马区bax表达明显减少。表明通脉醒脑滴丸能通过下调凋亡促进因子bax的表达，抑制cyt-c释放，对抗缺血再灌注后脑神经细胞的凋亡，发挥脑缺血防治作用。
有研究发现，在生长发育过程中，神经系统的bcl-2蛋白呈高表达，以后随年龄的增加bcl-2免疫反应迅速下降，成年后bcl-2蛋白的免疫反应通常不能检出，故假手术组未见bcl-2阳性表达。模型组仅出现少量bcl-2阳性表达，通脉醒脑滴丸组亦未见bcl-2阳性表达，提示药物对抗细胞凋亡的作用机制，可能主要与减少bax基因的表达，抑制cyt-c从线粒体的释放相关。
综上所述，通脉醒脑滴丸可通过减少缺血脑组织海马bax、cyt-c和caspase-3的阳性表达，抑制caspase-3介导的细胞凋亡，发挥对抗脑缺血的作用，为中药复方制剂防治脑缺血卒中的机理提供了新的佐证。
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