【摘要】 目的: 探讨核心蛋白聚糖(decorin, dcn)对huh7细胞系体外增殖的影响及机制。方法: 加入不同浓度(0、 25、 50、 75、 100、 125、 150、 200 μg/l)的dcn培养huh7细胞系不同时间(12、 24、 48、 72 h和2周), 用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(mtt)法及克隆实验测定细胞增殖速度和活力, 流式细胞术测定细胞周期和凋亡情况。结果: dcn浓度增加及作用时间延长, 细胞增殖速度减慢、 活力减低, g1期细胞增多, 凋亡增加。结论: dcn可能为一种负性调控蛋白, 可通过调节细胞周期, 抑制肝癌细胞的增殖, 促进其凋亡。
【关键词】 核心蛋白聚糖; huh7; 细胞周期; 凋亡
effects and mechanism of decorin on the proliferation of huh7 hepatoma carcinoma cells in vitro
shangguan jianying, dou kefeng, li xiao, hu xiaojun, zhang fuqin, yong zhaosheng, ti zhenyu*
department of hepatobiliary surgery, xijing hospital, fourth military medical university, xi’an 710032, china
[abstract] aim: to investigate the effects and mechanism of decorin( dcn) on the proliferation of huh7 hepatoma carcinoma cell line in vitro. methods: hepatoma carcinoma cells was cultured with dcn in different concentration (0, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200 μg/l) for different time(12, 24, 48, 72 h and 2 weeks). cell activities were studied by mtt and clone test. the changes of cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry. results: the proliferation of huh7 cells could be inhibited by dcn in vitro and the inhibition effect was the time and dose dependent relationship. dcn could block cell cycle at g1 phase. apoptosis of hepatocarcinoma cells could be efficiently induced by dcn in a time/dosedependent manner. conclusion: dcn may be a negative regulatory protein inhibiting hepatoma carcinoma cell proliferation through inhibiting cell cycle and inducing apoptosis of cell in vitro.
[keywords]decorin; huh7; cell cycle; apoptosis
核心蛋白聚糖(decorin, dcn)是富含亮氨酸的小分子的蛋白聚糖家族中的一员, 主要由结缔组织产生, 是一种多效性分子[1]。wWw.11665.com有许多资料表明dcn是一种抗增殖因子, 能够抑制多种细胞增殖, 极可能是一种肿瘤抑制物, 使转化的细胞和肿瘤静止[2], 这提示dcn有可能成为新的抗肿瘤药物。本实验旨在探讨dcn对人肝癌细胞生长的影响及其作用机制, 为肝癌的防治提供新的思路。
1 材料和方法
1.1 材料 人类肝癌细胞huh7细胞由本实验室提供。rpmi 1640培养基购于gibco公司, 按说明以双蒸水溶解, 滤膜过滤除菌, 分装, -20℃冻存备用。新生牛血清为杭州四季青生物工程材料公司产品, 经56℃ 30 min水浴灭活后, -20℃冻存备用。96孔、 6孔细胞培养板为corningcostar公司产品。recombinant human decorin(catalog number: 43de)购自美国r&d公司, 用pbs稀释浓度为1 000 μg/l, -20℃冻存备用。hepa class100 co2孵箱为thermo公司产品, ckx41荧光倒置显微镜为日本olympus公司产品, 流式细胞仪为beckman coulter公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 huh7细胞培养于100 ml/l新生牛血清rpmi1640培养液中, 含 105 u/l青霉素, 100 mg/l链霉素, 培养条件为37℃、 50 ml/l co2、 饱和湿度。培养的细胞均为上皮样贴壁生长, 细胞密度(0.1～1)×109/l, 每3～4 d传代1次, 取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 细胞处理 取对数生长期细胞调整密度至1×109/l, 接种于96孔板, 100 μl/孔。接种24 h后换液, 分别加入含0、 25、 50、 75、 100、 150、 200 μg/l dcn的培养液, 分别以pbs为空白对照、 不含dcn培养液为阴性对照, 每孔设4个复孔, 分别于12、 24、 48、 72 h用mtt法检测吸光度(a490值), 并绘制曲线。取对数生长期细胞接种于6孔板, 200个细胞/孔。接种24 h后换液, 分别加入含0、 25、 50、 75、 100、 125、 150 μg/l dcn的培养液, 分别以pbs为空白对照、 不含dcn培养液为阴性对照培养2周, 当培养皿中出现肉眼可见的克隆时, 终止培养, 甲醇固定, 吉姆萨染色后计克隆数, 计算克隆率, 并绘制曲线。
1.2.3 流式细胞术检测细胞周期和凋亡 收集对数期生长的huh7细胞, 配成单细胞悬液(1×109/l), 与浓度为0、 25、 50、 75、 100、 150 μg/l的dcn共同孵育96 h, pbs清洗, 标本用胰蛋白酶消化成细胞悬液, 其中一份标本用pbs洗涤2次并将细胞密度调整为109/l。首先用微量移液枪移取20 μl细胞悬液, 然后细胞悬液中加入annexinv并避光静置15 min后, 将pi染料加入并静置30 min, 上机检测。另一份标本加无水乙醇固定。pbs洗涤乙醇, 取细胞悬液2 ml, 以1 500 r/min离心5 min, 弃上清, 轻轻摇动, 加入pi去污染液(含10 ml/l tritonx100)2 ml, 避光染色10 min。流式细胞仪检测, 每份标本测定20 000个细胞, 测量速率为150～200个细胞/s。用multicycle for windows软件分析被采集资料。
1.2.4 统计学分析 数据用x±s表示, 应用spss15.0软件包进行统计分析, 不同时间及浓度dcn对细胞增殖情况、 细胞周期及凋亡率影响的比较采用snkq检验, 检验水准取α=0.05。
2 结果
2.1 dcn不同浓度及时间对huh7细胞增殖的影响 huh7细胞经dcn作用不同时间, 其吸光度在同一时间点随作用浓度增加而逐渐降低, 说明细胞增殖随dcn浓度增加而逐渐减弱; 同一浓度dcn作用, 随着作用时间的延长, 吸光度增加速度逐渐减慢, 说明较对照组细胞增殖活力减低(图1, p<0.05
2.2 dcn作用浓度对huh7细胞增殖的影响 将不同浓度dcn作用huh7细胞96 h后吸光度(a490值)结果做统计分析(表1)。显示不同浓度dcn a值与阴性对照组比较差异有统计学意义(p<0.05或p<0.01), 表明不同浓度dcn对细胞增殖的影响不同, 且随浓度增加, 抑制效果逐渐增强。
2.3 克隆实验结果 huh7细胞以不同浓度dcn培养2周, 出现肉眼可见克隆, 处理后计数并计算克隆率(clone rate), 结果显示, 随着dcn浓度增加, 细胞克隆率呈下降趋势, 这表明dcn对huh7增殖有一定抑制作用(图2)。表1 不同浓度dcn作用huh7细胞96 h a值
2.4 dcn对huh7细胞周期和凋亡率的影响 随着dcn浓度的增加, huh7的g1期细胞数明显增多, s期细胞数明显减少, g2期细胞数则无明显变化规律, 同时凋亡细胞率逐渐升高 (图3、 4)。
3 讨论
dcn是在细胞外基质中存在的小分子蛋白聚糖, 与肿瘤的发生、 发展密切相关。santra等[3]将dcn cdna稳定转染人乳腺癌mda453细胞, 这些被成功转染的细胞克隆表现明显的生长抑制, 细胞克隆在软琼脂上不形成集落, 在scid小鼠中不形成肿瘤, 并且g1期细胞增加。此外, nash等[4]研究发现直接加入人dcn能够抑制卵巢癌细胞系skov3和2774细胞的增长, 并且与抗肿瘤药物卡铂有协同作用。koninger等[5]研究发现直接加入人dcn能够抑制胰腺癌细胞系的增殖, tralho等[6]进一步报道腺病毒介导的dcn cdna的表达能够使肿瘤细胞在小鼠体内凋亡并且可以抑制对侧肿瘤细胞的生长, 而且这种抑制还是特异性的, 正常组织细胞却不发生凋亡和生长抑制。
本研究显示dcn可抑制体外培养huh7细胞增殖, 流式细胞术检测g0期细胞显著增多, g1期细胞周期阻滞, g0/g1期的肿瘤细胞比率越高, 表明dcn可以延缓肿瘤细胞由g1期向s期的过渡, 使s期和g2期细胞明显降低, 提示dcn可能影响细胞周期细胞, 使huh7细胞多数停滞于dna合成前期, dna合成障碍, 使肿瘤细胞的倍增时间延长[7]。同时本实验中经dcn作用后的huh7细胞凋亡率显著地增高, 提示诱导凋亡亦可能是dcn抑制肝癌细胞的机制之一。国内外有关dcn文献报道其有效工作浓度基本上都是在mg/l水平, 本实验将重组人dcn用pbs稀释成1 000 μg/l, -20℃冻存备用。在预实验及实验时均得出理想的结果, 而且随剂量增大及时间的延长抑制效果明显增加。在肝癌细胞体外培养小剂量dcn未见到刺激细胞增殖作用, 这可能早期国内报道dcn对正常肝细胞及肝星形细胞有双重调节作用不同, 即0.01 mg/l dcn可刺激正常肝细胞及肝星形细胞的增殖; 5、 10 mg/l dcn则具有抑制细胞生长的作用, 这可能提示dcn在肝癌中的作用不同于正常肝细胞, 小剂量dcn对肝癌细胞系huh7即有明显抑制效果可能也与其本身生长特性也有一定关系。国外报道dcn最高浓度用到500 mg/l, 且发现增加到一定剂量后, 细胞抑制效果不再增加[4]。本实验所用小剂量有明显抑制作用, 但由于剂量普遍偏小, 未发现抑制效应平台期, dcn对于肝癌细胞系进一步作用效果有待于深入研究。
目前对肝癌治疗尚没有理想的药物, dcn的发现为防治肝癌开辟了新的途径。dcn是机体本身所有的细胞外基质的成份, 从组织中提取天然的dc有广泛的来源和技术上的可行性, 基因克隆技术也已成功获得dcn, 使得dcn在肝癌的防治中具有良好的应用前景。我们观察了不同浓度dcn作用不同时间对人肝癌细胞株huh7细胞体外生长的影响, 结果显示, dcn能够抑制huh7细胞的体外增殖, 抑制g1/s期转换, 抑制肿瘤细胞的生长, 具有抗肿瘤作用和肿瘤组织的分化调节作用, 且这种增殖抑制和诱导凋亡作用呈剂量依赖性和时间依赖性, 随着dcn浓度的增加, 作用逐渐呈上升趋势。这提示我们如果dcn用于临床抗肝癌治疗时, 必需有足够用药计量和用药时间, 从而维持有效浓度, 才能更好的发挥抗肿瘤作用。
【参考文献】
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[2] reed cc, gauldie j, iozzo rv. suppression of tumorigenicity by adenovirusmediated gene transfer of decorin[j]. oncogene, 2002, 21 (23): 3688-3695.
[3] santra m, skorski t, calabretta b, et al. de novo decorin gene expression suppresses the malignant phenotype in human colon cancer cells[j]. proc natl acad sci usa, 1995, 92(15): 7016-7020.
[4] nash ma, loercher ae, freedman rs. in vitro growth inhibition of ovarian cancer cells by decorin: synergism of action between decorin and carboplatin[j]. cancer res, 1999, 59: 6192-6196.
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[6] tralho jg, schaefer l, micegova m, et al. in vivo selective and distant killing of cancer cells using adenovirusmediated decorin gene transfer[j]. faseb j, 2003, 17(3): 464-466.
