【摘要】  目的初步探讨丹参酮主要成分丹参酮iia对血管性痴呆小鼠的神经保护作用机制。方法双侧颈总动脉反复缺血/再灌注合并尾部放血降压方法建立血管性痴呆小鼠模型。动物随机分为假手术组、缺血模型组、丹参酮iia低、高剂量（4 mg/kg.d，8 mg/kg.d ）治疗组。手术20 d后开始运用morris水迷宫观测各组的学习记忆功能，然后断头取脑，分离皮层和海马组织，分光光度法测定丙二醛(malondialdehyde, mda) 含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, sod)以及谷胱甘肽过氧化物酶（gsh-px）活性的变化；运用高效液相色谱法测定不同组小鼠皮层和海马组织内谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量。结果①丹参酮iia可以改善血管性痴呆小鼠的学习记忆功能； ②丹参酮iia可减少mda的生成, 增加sod、gsh-px活性; ③小鼠手术20 d后，小鼠皮层和海马组织谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量减低，丹参酮iia可增加血管性痴呆小鼠皮层和海马组织内谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量。结论丹参酮iia在血管性痴呆小鼠可发挥抗氧化作用并调节兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸的含量。

【关键词】  丹参酮iia; 谷氨酸; γ-氨基丁酸； 血管性痴呆

　　abstract：objectiveto investigate the underlying neuroprotective mechanisms of tanshinone iia (tsa) on mouse cerebral ischemia in vivo.methodsmale mice were divided into four groups 〔sham-operated, ischemic and treated groups (lower dose and higher dose)〕. the mice were subjected for ischemia-reperfusion three times on bilateral common carotid arteries by knots to establish models of vascular dementia. after ischemia-reperfusion impairment, tsa (4 mg/kg.d, 8 mg/kg.d) was administered by i.p. for 20 days in treated group. 1. we used morris water maze to investigate the learning and memory； 2. levels of malondialdehyde (mda), activity of superoxide dismetase (sod) and glutathione peroxidase (gpx) in brain tissue were detected by spectrophotometer; 3. high-performance liquid chromatography(hplc) with fluorescence detection was applied to measure the contents of glutamate and gamma-aminobutyric acid (gaba) in cortex and hippocampus.results①tsa can improve learning and memory deficits in vascular dementia; ②an elevation of sod and gpx activity and decrease of mda level were shown in tsa treated group after brain ischemia; ③decreased  glutamate and gamma-aminobutyric acid induced by chronic brain ischemia were markedly inhibited by tsa pretreatment. conclusionthe neuroprotective effect of  tsa are partly due to its functions as follow: anti-free radical injury; regulating the content of glutamate and gamma-aminobutyric acid.

　　key words： tanshinone iia;   glutamate;   gaba;   vascular dementia
   
　　血管性痴呆(vascular dementia,vd)是指由各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征,为一种慢性进行性疾病,其病理改变主要是以广泛性脑动脉硬化和脑梗塞为特征, 随着当今世界人口老龄化日益严重,其发病率日趋增高［1］。wWW.11665.com我国中药资源丰富, 从祖国传统中草药中寻找有效成分治疗血管性痴呆不失为一条可以探索的道路, 研究者们已经在这方面做出了一些卓有成效的工作。丹参是我国传统中药, 丹参酮是丹参脂溶性成分的代表物质, 具有清除氧自由基、改善微循环、钙拮抗、抑制中性粒细胞的游走、抗癌及保护血管内皮细胞等广泛的药理作用, 现已成为研究的热点［2，3］。目前已发现它有十多种单体, 其中丹参酮iia(tsa)的研究最多, 已有报道指出丹参酮iia能显著降低心肌缺血再灌注后组织中mda的生成和减少心肌肌酸激酶的释放, 认为它直接清除氧自由基是防治家兔心肌缺血再灌注损伤的机理之一［4, 5］。另有报道丹参酮对中风模型大鼠有一定的神经保护作用［3］，但有关其神经保护机制目前仍然不甚清楚，相关研究工作开展较少, 本课题对这方面进行了初步的探索, 利用小鼠血管性痴呆模型观察丹参酮iia对其是否有治疗作用, 并探讨丹参酮iia对血管性痴呆小鼠是否有抗氧化作用以及对皮层和海马组织兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸的影响。

　　1  材料与仪器

    丹参酮iia（红色结晶粉末， 纯度>98％），购于西安冠宇生物技术有限公司；谷氨酸和γ-氨基丁酸标准品均购自 sigma 公司(st. louis, mo, usa); β-巯基乙醇购自 amresco inc. (ohio, usa); 邻苯二甲醛(o-phthaldialdehyde, opa) 购自sigma (st. louis, mo, usa); 甲醇(色谱纯)购自fisher scientific (usa); 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硼酸钠均为国产分析纯，实验前用四蒸水配成所需浓度；mda, sod,gsh-px以及蛋白定量试剂盒（考马斯亮兰法）购自南京建成生物 工程公司（南京，中国）。 varian prostar高效液相色谱仪；varian 363型荧光检测器；依利特ods c18反相色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)。 清洁级雄性昆明种小鼠, 体质量18～27 g, 由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

　　2 方法

　　2.1  动物分组和模型制备方法将实验小鼠随机分为4组：①假手术组；②血管性痴呆组；③丹参酮iia低剂量治疗组；④丹参酮ⅱa高剂量治疗组。
   
　　痴呆动物模型的制备：将小鼠适应性饲养 1周后, 参照文献［6］行双侧颈总动脉反复缺血/再灌注合并尾部放血降压方法建立vd小鼠模型。术前 12 h 禁食不禁水。用水合氯醛以350 mg/kg的浓度腹腔注射麻醉后, 将小鼠仰卧固定于手术台上。消毒后沿颈正中切口, 分离双侧颈总动脉 （cca）, 丝线结扎阻断 cca, 20 min后再灌注 10 min, 如此反复两次 , 第 1次缺血时在距小鼠尾尖 1 cm处剪断放血约 0.3 ml。术中保持动物肛温在 （37 ± 0.5） ℃。其中假手术组只分离cca, 套丝扣, 但不阻断血流, 尾部不放血, 观察时间与其他组相同。
   
　　丹参酮iia治疗组，术后第2天开始腹腔注射给药，给予丹参酮iia 4 mg/kg（低剂量组）或8 mg/kg（高剂量组）, 共20 d。

　　2.2  学习记忆功能测定利用morris水迷宫对各组动物学习记忆能力进行检测, morris水迷宫实验系统由中国医学科学院药物研究所研制。基本方法参照文献［7］。各组均于造模30 d后开始进行，每组取7～10只动物进行测试。数据由水迷宫实验软件系统获得, 实验数据以± s表示, 各组数据用spss 12.0统计软件处理, 采用重复测量方差分析结合tukey's 检验, p< 0.05有统计学差异。

　　2.3  mda含量，sod及gpx活性的测定方法操作均按照试剂盒说明书进行。

　　2.4  高效液相色谱法测定海马组织内氨基酸含量

　　2.4.1  样本处理将各组小鼠快速断头取出全脑，在冰板上迅速分离出皮层和海马，用冰生理盐水1:9(mg/ml)匀浆，低温离心机4℃ 3 500r/min离心15 min，取上清液50 μl进行蛋白定量；取上清200 μl 加入4 倍体积的冰冷甲醇，充分混匀后，4℃放置2 h，13 400 r/min 离心20 min，取上清待测。

　　2.4.2  色谱条件参照文献［7］。

　　2.5  统计分析采用spss 12.0软件进行统计分析。所有数据以± s表示。多组间均数比较采用one-way analysis of variance (anova)及fisher lsd test (least-significant difference)。p﹤0.05 有统计学差异。

　　3  结果

　　3.1  丹参酮iia对血管性痴呆小鼠认知功能障碍的作用

　　3.1.1  丹参酮iia对逃避潜伏期的影响实验过程中可见小鼠在第1，2轮训练中，各组找到平台时间均较长，从第3轮开始，随着训练次数增加，逃避潜伏期总趋势不断缩短。学习训练结束时，假手术组、血管性痴呆组、丹参酮iia低剂量组、丹参酮iia高剂量组逃避潜伏期分别为（3.69 ± 0.48） s，（40.28 ± 8.33 ）s，（14.28 ± 3.27 ）s，（7.18 ± 2.59 ）s。模型组与假手术组比较逃避潜伏期有显著性差异（p<0.05）；丹参酮iia低剂量组、丹参酮iia高剂量组明显缩短潜伏期，与模型组比较有显著性差异（p<0.05），但高剂量组与低剂量组之间并无统计学差异（p>0.05）。见图1。

　　3.1.2  丹参酮iia对空间记忆能力的影响假手术组、血管性痴呆组、丹参酮iia低剂量组、丹参酮iia高剂量组在原平台所在象限探索时间占探索总时间百分比分别为(56.24 ± 11.39)%，（21.31 ± 4.21）%，(34.29 ± 8.25)%，（38.56 ± 5.77）%。见图2。

　　3.2  丹参酮iia对血管性痴呆小鼠mda含量、sod和gsh-px的影响与假手术组相比，缺血性脑损伤30 d后，小鼠皮层和海马mda含量均显著增加（p<0.01），丹参酮ⅱa明显降低缺血性脑损伤后mda的产生（图3）,而且丹参酮iia作用呈剂量依赖性。

    与假手术组相比，缺血性脑损伤30 d后，小鼠皮层和海马gsh-px活性均显著降低（p<0.05），丹参酮iia明显增加缺血性脑损伤后gsh-px的活性（图4）, 而且丹参酮iia作用呈剂量依赖性。
   
　　与假手术组相比，缺血性脑损伤30 d后，小鼠皮层和海马sod活性均显著降低（p<0.05），丹参酮iia明显增加缺血性脑损伤后sod的活性（图5）, 而且丹参酮iia作用呈剂量依赖性。

　　3.3  丹参酮iia对血管性痴呆小鼠皮层和海马组织谷氨酸和γ-氨基丁酸含量的影响如图6所示，血管性痴呆小鼠皮层谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量均明显低于假手术组（p<0.05）；而丹参酮iia组小鼠谷氨酸和γ-氨基丁酸含量与血管性痴呆组比较，均明显增加，具有统计学意义（p<0.05）。
   
　　如图7所示，血管性痴呆小鼠海马谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量均明显低于假手术组（p<0.05）；而丹参酮iia组小鼠谷氨酸和γ-氨基丁酸含量与血管性痴呆组比较，均明显增加，具有统计学意义（p<0.05）。

　　4 讨论

    本实验行为学结果显示, 术后30 d模型组出现明显的学习记忆功能障碍, 表现为逃离潜伏期的延长和在目标象限中游泳时间的缩短, 而丹参酮iia治疗组则学习记忆成绩明显好于模型组, 表明丹参酮iia能改善学习记忆能力。
   
　　大量研究表明, 氧化应激损伤在多种神经退行性病变包括神经元缺血性损伤中亦起关键作用［8］。脑缺血和再灌流期间产生大量的自由基, 使mda含量升高, 并消耗sod而使其活性下降, 而且自由基的大量产生是迟发性神经元损害的主要原因。一方面由于反复脑缺血再灌流, 使缺血组织不断得到大量新的氧供, 结果大量激活黄嘌呤氧化酶, 产生大量超氧阴离子自由基并广泛攻击富含不饱和脂肪酸双键的神经元膜和微血管, 引发脂质过氧化“瀑布状”连锁反应和微循环障碍,致使大量神经元损害；另一方面又使缺血期间因氧耗竭而停滞的烷自由基向脂质过氧化物自由基转化得以延续, 造成新的恶性循环。此时, 体内抗氧化剂被自由基大量消耗, 而反应所产生的自由基又超过了体内清除能力, 缺血组织中自由基急速蓄积, 必然进一步攻击其他细胞的生物膜结构, 造成更多的细胞坏死,半暗带区进一步恶化, 梗塞范围迅速扩展［9］。已有报道指出丹参酮iia在心肌缺血再灌注后组织中表现出很强的抗氧化作用［2］，本实验亦表明丹参酮iia降低缺血小鼠脑内mda含量，增加gsh-px和sod活性，对慢性脑缺血动物表现出良好的抗氧化作用，故推测丹参酮iia的抗氧化作用可能是其发挥神经保护作用的机制之一。
   
　　目前均认为, 缺血性脑损伤与兴奋性氨基酸的毒性作用有关, 较多报道均指出脑缺血急性期神经细胞外液主要的兴奋性氨基酸谷氨酸水平都有较明显升高, 但随着缺血时间的延长, 其水平逐渐恢复到正常水平［10］。关于较长时间的慢性低灌注导致的小鼠不完全性脑缺血后脑组织内氨基酸水平如何变化目前国外报道并不多见, 国内较多报道均认为血管性痴呆模型小鼠脑组织内兴奋性氨基酸水平升高［11］。但本实验发现血管性痴呆模型小鼠皮层和海马组织内谷氨酸和γ-氨基丁酸含量均较假手术组小鼠脑内氨基酸含量低, 且有统计学意义(p<0.05), 而丹参酮iia治疗组的小鼠脑内谷氨酸和γ-氨基丁酸含量则均高于血管性痴呆模型组。血管性痴呆模型小鼠谷氨酸和γ-氨基丁酸含量降低是否可以这样理解:缺血初期, 由于能量障碍, 大量兴奋性氨基酸释放, 触发兴奋性毒性作用, 而较长时间大脑供血不足后, 脑细胞代谢障碍, 使各种氨基酸吸收和合成障碍, 故而谷氨酸和γ-氨基丁酸含量均减少低于正常水平。本实验结果表明, 长期慢性脑缺血可使小鼠脑组织内谷氨酸和γ-氨基丁酸含量均降低, 而谷氨酸和γ-氨基丁酸为中枢神经活动必需氨基酸，丹参酮ⅱa通过提高脑组织内谷氨酸和γ-氨基丁酸含量, 改善血管性痴呆模型小鼠的学习记忆功能, 加强神经电生理活动, 这一作用对血管性痴呆病人的治疗可能有一定益处。
    
　　总之，丹参酮iia在血管性痴呆模型小鼠可改善其学习记忆，表现出较强抗氧化作用，同时能够调节兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸的含量。除了上述两种作用机制之外，笔者推测亦有可能有其他机制参与其神经保护作用，尚需要进一步的研究，从而阐明丹参酮的神经保护作用机制，为临床上更好的利用丹参酮治疗脑缺血性病人提供理论依据。

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