作者：杨萍，李杰，周凤华，李丽君，贾钰华
【摘要】 目的观察丹参酮ⅱa对过氧化氢诱导的心肌细胞损伤的保护作用及其机制。方法采用差数贴壁法体外分离培养新生乳鼠心肌细胞，以200 μmol/l过氧化氢作用2 h 模拟心肌细胞氧化应激模型，分别以丹参酮ⅱa高、中、低剂量在造模前干预24 h。采用mtt法检测细胞活力，流式细胞仪annexin v-pi双染法检测细胞凋亡率，检测心肌细胞总抗氧化能力（t-aoc）、ldh活性、mda含量、sod活力、gsh-px活力、cat活力。结果模型组心肌细胞经200 μmol/l过氧化氢作用2h后，细胞活力显著降低，凋亡率显著增高。与模型组比较，丹参酮ⅱa显著增加心肌细胞活力，降低细胞凋亡率。过氧化氢可导致心肌细胞ldh活性及mda含量显著增加，并使总抗氧化能力（t-aoc）、sod活力、gsh-px活力、cat活力显著降低，丹参酮ⅱa可呈浓度依赖性显著降低ldh活性及mda含量，增加总抗氧化能力（t-aoc）、sod活力、gsh-px活力、cat活力。结论丹参酮ⅱa可以抑制过氧化氢诱导的心肌细胞损伤，这可能与其增强细胞抗氧化酶活力，降低脂质过氧化反应有关。
【关键词】 丹参酮ⅱa； 心肌细胞； 氧化应激
chinaabstract：objectiveto study the protective effect and mechanism of tanshinone ⅱa on myocardial damage induced by hydrogen peroxide.methodsprimary cultured neonate rat myocardial cell was cultured in medium with 200μmol/l hydrogen peroxide, and the medium was supplemented with different concentrations of tanshinone ⅱa in advance. cell viability was determined by mtt method. annexin v/pi bivariate dyeing was used to detect apoptosis rate. besides, t-aoc, ldh, mda, sod, gsh-px, cat were detected to evaluate cell antioxidant ability.resultsin model group, cell viability decreased significantly and apoptosis rate rose significantly compared with normal group. compared with model group, tanshinone ⅱa increased cell viability and decreased apoptosis rate in a dose-dependent manner. compared with normal group, ldh and mda increased remarkably, and t-aoc, sod, gsh-px, cat were dropped remarkably in model group. compared with model group, tanshinone ⅱa decreased ldh and mda significantly ,and increased t-aoc, sod, gsh-px, cat significantly in a dose-dependent manner. conclusiontanshinone ⅱa can reduce myocardial damage induced by hydrogen peroxide, the mechanism may be related with the enhancement antioxidase activity, and decrease of lipid peroxidation.
key words：tanshinone ⅱa; myocardial cell; oxidative stress
随着冠状动脉内溶栓、冠脉球囊扩张及冠脉搭桥等内外科治疗缺血性心脏病手段的广泛应用，在恢复缺血心肌的再灌注挽救缺血心肌的同时，缺血/再灌注( ischemia/reperfusion, i/r)损伤所带来的问题日益明显［1］。WWW.11665.cOM许多实验研究已证明，在心肌损伤区有大量自由基产生，自由基产生的氧化损伤是心肌损伤的重要因素，而应用自由基清除剂可以减轻组织细胞的损伤［2］。丹参是我国的传统中药，被广泛用于冠心病的治疗。丹参酮ⅱa（tanshinoneⅱ,tsn）是丹参最重要的生物活性部分［3］。本实验以体外培养的乳鼠心肌细胞为基础，以h2o2诱导细胞损伤为模型，旨在研究丹参酮ⅱa在氧化应激条件下对心肌细胞的保护作用，探讨其可能的作用机制，阐释丹参治疗心肌缺血性疾病的机理。
1 材料
1.1 动物出生1～3 d雄性wistar大鼠，spf级，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号scxk粤-20060015。
1.2 药品与试剂
胎牛血清购自杭州四季青生物工程研究所；胰蛋白酶、dmem培养基购于gibico公司；丹参酮ⅱa购于中国药品生物制品检定所（批号110766-200417）；乳酸脱氢酶(ldh)测定试剂盒、丙二醛(mda)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(sod)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（gsh-px）、过氧化氢酶(cat)测定试剂盒、总抗氧化能力（t-aoc）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。
2 方法
2.1 分组原代乳鼠心肌细胞经分离、纯化后进行实验分组，分为以下几组：①正常组：培养的正常心肌细胞培养；②模型组：心肌细胞培养液中添加200 μmol/l h2o2作用2 h；③丹参酮ⅱa高剂量组：心肌细胞用丹参酮ⅱa 1×10-4mol/l培养24h后添加200 μmol/l h2o2继续作用2 h。④丹参酮ⅱa中剂量组：心肌细胞用丹参酮ⅱa 5×10-5mol/l培养24 h后添加200 μmol/l h2o2继续作用2 h。⑤丹参酮ⅱa低剂量组：心肌细胞用丹参酮ⅱa 1×10-5mol/l培养24 h后添加200 μmol/l h2o2继续作用2 h。
2.2 新生大鼠心肌细胞培养参照goldenberg等［4］方法略加改进。取出生1～3 d sd乳鼠，在75％酒精中浸泡8s后取出，固定四肢。用无菌眼科剪剪开胸部，无菌眼科弯镊取出心脏。迅速将心脏放入装有冷d-hanks液的培养皿中，去除心房及心外膜的结缔组织，将心室剪开，洗净残血，反复洗3次。将心室肌在无菌培养皿侧壁剪碎成1～2 mm3的小组织块。将小组织块移入50 ml塑料离心管中，加入0.1％胰蛋白酶5ml，37℃消化6 min。自然沉淀后去除第1次上清，再加入5 ml胰蛋白酶于37℃消化6 min后，轻轻吹打，自然沉淀后，取上清移入15 ml离心管中，加含血清培养基终止消化，1 000 r/min离心10 min，洗两次。剩余沉淀继续加胰蛋白酶消化，如此反复消化7～10次直至组织块完全消化。将离心所得沉淀用含15％胎牛血清的培养基制成细胞悬液，在co2培养箱中差速贴壁1 h，去除非心肌细胞（主要是成纤维细胞和内皮细胞）。1 h后轻轻吸出细胞悬液，调整细胞密度，将心肌细胞悬液均匀接种于6孔板内，置于二氧化碳培养箱中培养。前48 h加入终浓度为0.1 mmol/l的5-溴脱氧尿苷，每24 h换液1次。
2.3 心肌细胞活力检测 采用mtt比色法测定心肌细胞活力。心肌细胞悬液以1.5×104/ml接种于96孔板。分组处理后，每孔加入20 μl mtt（5 mg/ml），在培养箱中37℃孵育4 h。吸去上清，每孔加入dmso 150 μl。微孔振荡器上振荡10 min。酶标仪检测570 nm波长的吸光度值。每孔od值减去空白孔od值为测试孔od值。活细胞数与od值成正比。每组每个时间点设6个复孔，取其平均值。
2.4 心肌细胞凋亡吸出培养液，d-hanks洗细胞3次，5 min/次。向培养瓶中加入2～3 ml 0.125％胰蛋白酶（使用前应预热至37℃左右），镜下观察细胞，待其变圆，细胞间分离但尚未脱落时倒去胰酶，加入原培养液终止消化，吹打瓶壁，使细胞脱落。将细胞悬液转移至离心管，1 000 r/min 离心5 min，加pbs重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/ml，取0.5 ml上述细胞悬液，1 000 r/min 4 min离心，弃上清，加0.5 ml binding buffer重悬细胞，加入1μl荧光标记的aannexin v试剂，混匀后避光室温下孵育20 min。加入5μl pi混匀后避光4℃下孵育5 min，孵育后加入500 μl binding buffer，立即上流式细胞仪分析，激发波长ex=488 nm; 发射波长em=530 nm。
2.5 总抗氧化能力及氧化平衡体系酶测定
采用比色法测定总抗氧化能力（t-aoc），采用2,4-二硝基苯肼显色法检测ldh活性，硫代巴比妥酸法测定mda含量，黄嘌呤氧化酶法测定sod活力，二硫代二硝基苯甲酸法测定gsh-px含量，钼酸铵法测定cat活力。具体操作步骤参照试剂盒说明书。
2.6 统计分析
计量数据以均±s表示，采用 spss13. 0统计软件进行分析。多组数据间比较采用单因素方差分析 (one way anova)处理，组间两两比较采用lsd法。检验显著性水准α＝0.05。
3 结果
3.1 丹参酮ⅱa对过氧化氢所致心肌细胞损伤的细胞活力与细胞凋亡的影响与正常组比较，模型组心肌细胞活力显著降低，细胞凋亡率则显著增加；在改善细胞活力方面，丹参酮ⅱa高剂量组细胞活力较模型组显著增高，而丹参酮ⅱa中剂量、低剂量 与模型组比较无统计学差异。在改善细胞凋亡率方面，丹参酮ⅱa各剂量组细胞凋亡率均显著低于模型组，中剂量与低剂量差异无统计学意义。结果见表1。表1 丹参酮ⅱa对过氧化氢所致心肌细胞损伤细胞活力及细胞凋亡率的影响（略）
3.2 丹参酮ⅱa对过氧化氢所致心肌细胞损伤抗氧化能力的影响与正常对照组比较，模型组心肌细胞总抗氧化能力、sod活性、gsh-px活性、cat活性显著降低，而ldh活性、mda含量则显著增加；丹参酮ⅱa可呈剂量依赖性增加总抗氧化能力、sod活性、gsh-px活性、cat活性，降低ldh活性、mda含量。结果见表2。表2 丹参酮ⅱa对过氧化氢所致心肌细胞损伤抗氧化能力
4 讨论
在i/r时可产生大量的活性氧自由基，是i/r介导细胞结构损伤和功能代谢障碍的重要途径之一［5］。许多实验研究已证明心肌缺血再灌注损伤不仅引起细胞坏死，而且也诱导细胞凋亡［6］。心肌细胞的过度凋亡会导致心肌细胞数量的减少以及心肌结构破坏和功能障碍。本研究结果显示，外源性h2o2 200μmol/l可以导致心肌细胞活力显著降低，凋亡发生率显著增高。氧自由基损害细胞主要表现在可使许多生物大分子如核酸、蛋白、脂肪酸引起过氧化反应，使生物大分子出现交联或者断裂，从而引起细胞结构和功能的破坏。mda是不饱和脂肪酸氧化的终产物，其水平的高低可反映机体脂质过氧化的程度。因此，测定mda水平可间接反映出细胞受氧化损伤程度，是反映氧化应激较好的指标［7］。自由基激发的脂质过氧化物可以导致质膜损伤，ldh漏出率能较准确地证明包膜的完整性［8］。在本研究中，体外培养的心肌细胞在h2o2诱导的损伤时，mda含量显著增高，表明心肌细胞在h2o2作用下产生了大量的脂质过氧化物。同时，细胞膜通透性发生改变，膜内ldh可透过细胞膜释放到培养液中，使培养液中ldh水平显著升高。
机体的氧化应激是由于氧自由基过量生成与自由基清除系统的平衡状态被破坏，导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集，从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态。超氧阴离子自由基(o2-·) 、羟基自由基(·oh)、过氧化氢(h2o2)和单线态氧(1o2)等是体内主要的活性氧（reactive oxygen species ,ros）。体内ros的增多可导致膜脂质发生过氧化、膜脆性增加、流动性降低［9］。sod、gsh-px、cat是体内有效的自由基清除剂，它们的催化活性对维持氧化平衡系统是非常重要的［10，11］。sod是一类金属酶，能催化-1价o2歧化(还原)成h2o2，在防御氧毒性中起着重要作用，sod活力下降可能是因为消除过多产生的o-2·所致。cat可催化h2o2分解，gsh-px可清除h2o2，阻断脂质过氧化的链锁反应，保护细胞膜结构和功能完整。cat和gsh-px降低可能是清除过多的h2o2引起的。另外，sod在消除o-2·时产生的h2o2进一步再被cat和gsh-px消除［12］，这也可能是cat和gsh-px降低的原因之一。t-aoc是在整体水平上反映机体或细胞抗氧化水平高低的重要指标。在本研究中，模型组t-aoc、sod活性、cat活性、gsh-px含量显著降低，表明外源性h2o2可导致心肌细胞抗氧化防御机制受损。
丹参酮ⅱa是我国的传统中药丹参重要的心血管活性成分，且具有抗缺血、改善微循环作用［13］。在本实验模拟的心肌细胞氧化应激模型中，丹参酮ⅱa可增加心肌细胞活力，降低细胞凋亡率。本实验通过检测心肌细胞经丹参酮ⅱa干预后的mda含量、ldh活性、t-aoc，sod活性、cat活性、gsh-px含量的水平，发现丹参酮ⅱa可呈浓度依赖性增加心肌细胞t-aoc、sod活性、cat活性、gsh-px含量，而mda含量、ldh活性则呈浓度依赖性显著降低。本实验结果表明，丹参酮ⅱa可提高心肌细胞对氧自由基的清除能力，降低脂质过氧化反应，从而减轻氧自由基介导的细胞膜结构与功能的损伤，以实现其对心肌细胞的氧化应激状态的保护作用。因此，在再灌注或恢复供氧早期给予丹参对于减轻心肌细胞损伤有着重要的意义。
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