作者：秦海燕，索志荣，刘文哲
【摘要】 目的测定丹参营养器官中丹参酮i和丹参酮ⅱa的含量，并揭示丹参生长过程中，丹参酮i和丹参酮ⅱa的动态变化规律。方法采用反相高效液相色谱法，以zorbax sb - c18（150 mm × 4.6 mm, 5.0 μm）为色谱柱；甲醇-0.4%磷酸为流动相，梯度洗脱，流速为1.0 ml/min；二极管阵列检测器：检测波长分别为246, 270 nm；柱温为30℃。结果丹参叶和茎中均未检出丹参酮i和丹参酮ⅱa，根中丹参酮ⅱa和丹参酮i的含量变化呈“单峰”曲线，丹参酮ⅱa的含量在7月份最高，为2.94%，丹参酮i含量在5月份最高，为0.78%。结论4月至7月是丹参根中丹参酮积累的关键时期。
【关键词】 丹参； 营养器官； 丹参酮； 高效液相色谱
abstract：objectiveto determine the content of tanshinoneⅱa and tanshinoneⅰ in different vegetative organs of salvia miltiorrhiza bge and discover the accumulation of tanshinoneⅱa and tanshinoneⅰ within a whole growth period. methodshigh performance liquid chromatography was used. the separation was performed on zorbax sb - c18（150 mm × 4.6 mm, 5.0 μm）column by gradient elution . the mobile phase consisted of ch3oh - 4% aqueous phosphoric acid. the flow rate was 1.0 ml/min. the detection was done at 246, 270 nm and column temperature was 30 ℃.resultsthere were no tanshinone in the stem and the leaf. tanshinoneⅱa and tanshinoneⅰroughly assumed "the single peak" in the root within a growth period.the highest content of tanshinoneⅱa was in july, up to 2.94% and tanshinoneⅰwas in may, up to 0.78%.conclusionapril to july is the critical period of tanshinone accumulation in danshen root.
key words：salvia miltiorrhiza bge; vegetative organs; tanshinone; high performance liquid chromatography
丹参（salvia miltiorrhiza bunge）为唇形科（labiatae）鼠尾草属多年生草本植物，传统以根入药。Www.11665.coM其活性成分可分为脂溶性的二萜醌类和水溶性的酚酸类成分，邻醌型的丹参酮ⅰ、丹参酮ⅱa在丹参中的量较高,有较强的生理活性,是丹参主要有效成分之一［1］，具有扩张血管,降低血液黏度,抗血小板聚集,改善微循环,保护心肌细胞以及抗菌消炎、抗癌等作用［2］。目前，关于丹参药用成分的药理、提取工艺、检测方法的研究较多，但有关丹参药用成分在整个营养器官动态变化的研究很少。本文采用高效液相色谱－二极管阵列检测器（hplc－dad），研究了丹参脂溶性成分丹参酮i和丹参酮ⅱa在根中的积累规律，旨在为丹参的种植、管理、采收、品质鉴定及控制丹参药材质量提供理论依据。
1 仪器与试药
hp1100高效液相色谱仪（美国aglient公司），包括四元梯度泵（g1311a）， 二极管阵列检测器(g1315a)；dl-180型超声清洗器(浙江省象山县石浦天电子仪器厂)；fz102微型植物试样粉碎机（河北省黄骅市齐家务振兴电器厂）；milli - qg超纯水制备仪（美国millipore公司）。
甲醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸为分析纯。丹参酮i和丹参酮ⅱa对照品纯度均大于99.5%，购自中国药品生物制品检定所。
丹参（salvia miltiorrhiza bunge）实验材料采于西北大学苗圃内的栽培植株（2006年3月自商洛天士力丹参药材基地移栽）。于2007-04 ～ 12期间每月20日以随机抽样的方式选择丹参植株6株，摘取各样品株的根、叶片和茎，分别整理，60℃的恒温箱内烘干至恒重，研细，过6号筛后备用。
2 方法
2.1 对照品溶液的配制分别精密称取对照品丹参酮i 1.1 mg和丹参酮ⅱa2.2 mg，分别置10 ml量瓶中，用二氯甲烷－甲醇（v/v = 1/9）混合溶剂溶解并定容，摇匀，得丹参酮i 浓度为0.11 mg·ml-1和丹参酮ⅱa浓度为0.22 mg·ml-1的单一成分对照品溶液，作为储备液，其它不同浓度的对照品溶液由储备液稀释得到。
2.2 供试品溶液的制备精密称量丹参根、茎、叶粉末约120 mg，置25 ml烧瓶中，准确加入二氯甲烷－甲醇（v/v = 1/9）混合溶剂10 ml，称重，超声提取30 min，冷却至室温，再称重，用提取液补足减失的质量，摇匀，取适量用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得丹参脂溶性成分供试品溶液。
2.3 色谱条件美国zorbax sb - c18（150 mm × 4.6 mm, 5.0 μm）色谱柱；流动相为甲醇 － 0.4%磷酸，梯度洗脱，其时间程序为0→10→13 min，甲醇体积分数相应为72%→87%→72%，流速1.0 ml·min-1；二极管阵列检测器：检测波长分别为246, 270 nm；柱温30 ℃。丹参酮i和丹参酮ⅱa的保留时间分别为8.1，10.8 min。对照品和丹参样品色谱图见图1。
2.4 线性关系考察精密移取“2.1”项所配的丹参酮i和丹参酮ⅱa储备液一定体积于10 ml量瓶中，稀释，配成丹参酮i浓度分别为0.44，0.88，1.76，3.52，7.04，14.08 μg·ml-1及丹参酮ⅱa浓度分别为4.4，8.8，17.6，26.4，35.2，70.4 μg·ml-1的混合对照品溶液，将上述混合对照品溶液分别平行测定3次（均进样10.0 μl），以平均峰面积y对浓度c(μg·ml-1)进行线性回归，丹参酮i和丹参酮ⅱa回归方程和相关系数分别为：y = 74.61c - 118.86，r= 0.999 4；y = 55.58c - 94.75，r = 0.999 6。线性范围分别为0.44 ～ 14.08，4.4 ～ 70.4 μg·ml-1。
2.5 精密度实验 精密吸取丹参（6月根）脂溶性成分供试品溶液10.0 μl，重复进样6次，进行测定，丹参酮i和丹参酮ⅱa峰面积积分值的rsd分别为1.7%，1.9%。
2.6 稳定性实验 对丹参（6月根）脂溶性成分供试品溶液在8 h之内每隔1 h进行考察，结果丹参酮i和丹参酮ⅱa峰面积积分值的rsd分别为2.1%，2.1%（n = 9）。
2.7 重复性实验 精密称量丹参（6月根）粉末约200 mg共6份，按“2.2”项操作制备脂溶性成分供试品溶液，进行测定，丹参酮i和丹参酮ⅱa含量的rsd分别为2.3%，2.5%。
2.8 加样回收率实验 精密称量丹参（6月根）粉末约60 mg，共6份，每份分别准确加入丹参酮i对照品储备液0.3 ml和丹参酮ⅱa对照品储备液1.0 ml，按“2.2”项操作制备脂溶性成分供试品溶液后，进行测定。丹参酮i和丹参酮ⅱa的平均加样回收率（n = 6）分别为99.4%，100.1%；rsd分别为2.3%，2.5%。
3 结果
按优化的高效液相色谱法对丹参的叶、茎、根中丹参酮i和丹参酮ⅱa的含量进行测定，每个样品重复测定3次，结果以平均含量计，本实验总脂溶性成分含量为丹参酮i和丹参酮ⅱa含量之和。
3. 1 脂溶性成分提取条件的选择 分别考察了回流提取法和超声提取法，结果显示：回流提取法和超声提取法均可达到同样的提取效率，但超声提取法提取时间明显缩短，提取操作简单方便，故本实验采用超声提取法。然后，分别考察了不同比例的二氯甲烷 - 甲醇溶剂及不同提取时间两种成分的提取率。实验结果显示，采用二氯甲烷 - 甲醇(1∶9) 作提取溶剂效果最好，超声提取0.5 h，丹参酮i和丹参酮ⅱa的提取率均达到最大，故本实验选择用二氯甲烷－甲醇（v/v= 1/9）混合溶剂超声提取0.5 h。
3.2 色谱条件的优化先后尝试了不同比例的甲醇-水-磷酸作为流动相的等度洗脱以及各种梯度洗脱，对色谱条件进行了优化。结果表明：随着流动相中甲醇比例的增加，洗脱能力增强，当采用等度洗脱时，在短时间内丹参酮i和丹参酮ⅱa分离效果不理想，因此采用梯度洗脱方式，经试验，本节优化的色谱条件分离效果相对最好。
3.3 检测条件的选择用dad对丹参酮i和丹参酮ⅱa进行190 ～ 400 nm全波长扫描，结果丹参酮i和丹参酮ⅱa的最大吸收波长分别为246和270 nm，故本实验采用双波长检测，在246 nm检测丹参酮i，在270 nm检测丹参酮ⅱa。
3.4 丹参叶和茎中脂溶性成分含量经检测，丹参叶和茎中均未检出丹参酮i和丹参酮ⅱa。
3.5 丹参根中脂溶性成分含量的季节变化在一个生长季节，丹参酮ⅱa和丹参酮i的含量变化规律大体呈“单峰”曲线（图2），丹参酮ⅱa的含量始终高于丹参酮i，丹参酮ⅱa从4月到7月份含量递增，7月份增至最高，为2.94%，以后含量递减，10月份后含量稳定在一个稍低的水平。丹参酮ⅰ在4～5月份含量增加，5月份增至最高，为0.78%，以后含量逐渐降低。总丹参酮含量在7月份最高，约为10月份后稳定期含量的2.47倍。
4 讨论
孙群等［3］认为4 ～ 6月份是丹参第一个营养生长期，根系长度、数量以及生长量均进入快速生长期，结合本实验结果推断，丹参在第1个营养生长期除了生物量增加，根中丹参酮含量也迅速增加，并且这是丹参酮含量增加的重要阶段。6月份后丹参进入生殖生长阶段，地上部分光合产物主要向以果实为中心的生殖器官运输分配,从而抑制了营养器官的生长［3］。6～7月份后丹参酮含量逐渐降低可能与代谢产物向生殖器官运输分配有关。9月上旬种子成熟以后，丹参由生殖生长转入第2个以根系生长为中心的营养生长阶段，丹参根系重量增加较快，直径迅速增粗。李磊等［4，5］发现丹参酮类化合物主要集中分布在根茎部的表皮，根直径大小与丹参酮ⅱa含量成负相关。 因此，9月份后，随着根重量、直径的增加，丹参酮ⅱa的含量却逐渐下降。10 ～ 11月份根系生长缓慢，丹参酮ⅱa的含量趋于稳定。
可见，4～7月是丹参根中丹参酮积累的关键时期，7月份后是根生物量增加的重要阶段，根据这一特点，应合理施肥、管理，以获得产量高、有效成分含量高的丹参药材。
【参考文献】
［1］赵娜，郭治昕，赵雪，等.丹参的化学成分与药理作用［j］.国外医药.植物药分册，2007，22（4）：155.
［2］张民,张骅,徐鹏，等.丹参酮ⅱa的药理作用研究进展［j］.医药导报，2008，27，（10）：1237.
［3］孙群, 梁宗锁, 王渭玲, 等.丹参移栽后苗系与根系的生长关系［j］. 中国中药杂志, 2005, 30(1): 23.
［4］李磊，胡广林，franks.c.lee，等.丹参抗氧化成分及其分布特性［j］.江西农业大学学报，2001，23（4）：487.
［5］陈悦, 曾令杰, 梁晖, 等.丹参酮ⅱa与丹酚酸b在丹参药材中的分布研究［j］.现代中药研究与实践, 2006, 20(2): 7.
