【摘要】 目的观察健脾活血中药对胃溃疡大鼠h+，k+-atp酶及壁细胞胃泌素受体作用的影响。方法采用放射配基受体结合测定技术分别检测各组壁细胞胃泌素受体结合位点数，同时分别检测各组大鼠h+，k+-atp酶活性及胃液总酸度。结果健脾活血组壁细胞胃泌素受体结合位点数低于正常大鼠(p<0.05)，胃液总酸度及h+, k+-atp酶活性升高(p<0.05)；奥美拉唑组壁细胞胃泌素受体结合位点数明显高于正常大鼠(p<0.05)，胃液总酸度及h+, k+-atp酶活性明显降低(p<0.05)；中西药组壁细胞胃泌素受体结合位点数、胃液总酸度及h+, k+-atp酶活性与正常大鼠比较无显著性差异(p>0.05)。结论健脾活血中药平缓地抑制胃壁细胞的h+, k+-atp酶活性，降低胃酸的分泌；同时，不影响胃泌素受体结合位点数，防止停药后反跳性过多泌酸。
【关键词】 胃溃疡； 壁细胞胃泌素受体； h+，k+-atp酶； 健脾活血中药
abstract：objectiveto observe the effects of jianpi huoxue recipe on the activities of h+，k+-atpase and gastrin receptor in gastric parietal cells of gastric ulcer in rats.methodsthe ligand-binding number of gastrin receptors on parietal cells was analysed in radioligand binding assay.total acidity of gastric ulcer， and h+，k+-atpase activities were measured．resultsthe gastrin receptor binding sites of parietal cells in jianpi huoxue group were obviously lower than that in the normal group， the total acidity of gastric juice and the activities of h+，k+-atpase were obviously higher than that in the normal group. the gastrin receptor binding sites of parietal cells in omeprazole group were obviously higher than that in the normal group. the total acidity of gastric juice and the activities of h+，k+-atpase in omeprazole group were obviously lower than that in the normal group. the gastrin receptor binding sites of parietal cells, the total acidities of gastric juice and h+，k+-atpase activity of parietal cells in combined group and in the normal group had no significance.conclusionjianpi huoxue recipe can inhibit the activities of h+，k+-atpase and the secretion of gastric acid gently.at the same time, the binding capacity of gastrin receptor in gastric parietal cells has no effect, so it can prevent excessive secretion of acid after drug withdrawal .
key words：gastric ulcer; gastrin receptor on parietal cells; h+,k+ atpase; jianpi huoxue recipe
中医药与中西医结合对消化性溃疡防治复发与保证其远期疗效取得了较好的成效。WWW.11665.cOM健脾活血法针对消化性溃疡的脾虚血瘀的特点，具有较好的临床远期效应的优势。为探讨其作用机制，特设计本实验。现报道如下。
1 材料
1.1 动物及主要试剂sd♂大鼠，体质量（200±20）g，由广东省卫生厅实验动物中心提供。125i-胃泌素购自中国原子能科学研究院，比活度为1 700 ci/mmol，放化纯度大于95%。胃泌素标准品及链霉蛋白酶由北京鼎国试剂公司提供(sigma生产)。h+，k+-atp酶活性测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
1.2 主要仪器及设备5500型γ计数器(beckman)，hys-4多头细胞收集器(上海跃进医疗器械厂)，hzs-h恒温水浴振荡器(哈尔滨东联电子有限公司)，xds-1倒置显微镜(重庆光电仪器厂)，tdz5-ws自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器公司)，多头磁力搅拌器(常州国华电器厂)；ldz5-2低速离心机（北京医用离心机厂）。
2 方法
2.1 药物、模型的制备及动物分组
健脾活血方以四君子汤为主方，配合活血药物而成：党参20 g，白术15 g，茯苓30 g，三七10 g，赤芍20 g，丹参15 g，黄芪30 g，白及30 g等。药材经生药学鉴定，常规水煎2次，浓缩至100%，使每毫升含生药1 g。大鼠胃溃疡模型制备采用乙酸大鼠胃溃疡模型［1］。大鼠造模苏醒后，按完全随机设计法将大鼠分为5组。①正常对照组：10只，系非造模大鼠，喂生理盐水0.09 g／(kg·d)；②模型组：10只，造模3 d开始喂生理盐水0.09 g／(kg·d)；③奥美拉唑组：10只，造模3 d开始喂奥美拉唑2 mg／(kg·d)；④健脾活血组：10只，造模3 d开始喂健脾活血药物1.0 g／(kg·d)；⑤中西治疗组：10只，造模3 d开始喂健脾活血药物1.0 g／(kg·d)+ 奥美拉唑2 mg／(kg·d)。于第22天断头处死。
2.2 大鼠胃壁细胞的分离与纯化
参照文献建立方法［2］。大鼠脱颈椎处死，剖腹取胃，结扎贲门和幽门。在胃底部做一小切口，用玻璃棒将胃袋翻转，用玻璃片刮下部分胃黏膜作h+，k+-atp酶活性测定。然后在胃底与胃体之间结扎，弃去胃底，用生理盐水将胃袋冲洗干净。把预先配制好的链酶蛋白酶(pronase)液约2.5 ml(1 g/l)注入胃袋。然后将胃袋放入预先通氧的a液(nah2po4，na2hpo4，nahco3，nacl，kcl，hepes，glucose，bsa，edtama)中，在37 ℃水浴消化30 min后转入b液(nah2po4，na2hpo4，nahco3，nacl，kcl，hepes，glucose，bsa，cacl2，mgcl2)中，用磁力搅拌器搅拌两次，各10 min，收集每次b液中打下的细胞悬液。此过程重复3次。所有收集到的细胞悬液均用200目尼龙网过滤，过滤液4 ℃，1 000 r/min，离心5 min，倾出上清液，沉淀用c液(b液+dtt) 混悬以供纯化。孵育过程皆充以950 ml/l 的o2 +50 ml/l 的co2。 取10 ml专用离心管，用吸管在管底分别铺2 ml 预先配制好的60%和40% percoll液制成不连续密度梯度分离液，将细胞悬液1 ml左右铺在最上层，然后4 ℃，2 000 r /min，离心20 min进行纯化，收集40%与60% percoll交界面处的壁细胞，c液洗两次，再用c液混悬备用。
2.3 胃泌素受体测定
根据预试(多点饱和实验)确定125i-胃泌素放射配基的近饱和终浓度为100 pmol/l，并以此为基础做单点结合实验，加样顺序如下(表1)。表1 胃泌素受体放射配基结合实验的加样顺序（略）
加样后37 ℃孵育30 min，加冰冷的c液720 ml终止反应，迅速用多头细胞收集器收集至玻璃纤维滤膜3次。烘干滤膜后，置于γ计数器测量放射性。特异性结合(sb)=总结合(tb)-非特异性结合(nsb)。以上均各做3个复管。特异结合位点数由以下公式求出: 位点数(单个细胞)=(特异结合×6.022×1023)/(计数效率×2.2×106×放射比活度×放化纯度×109×细胞总数)。
2.4 h+，k+-atp酶活性及胃液总酸度测定
用玻璃片刮下胃黏膜放入冻存管内，于-70℃保存待测，用于测定h+，k+-atp酶活性。将已制备的胃黏膜准确称重后加49倍生理盐水，用组织匀浆机制成2%组织匀浆。按照h+，k+-atp酶活性测定试剂盒说明进行操作。取胃时将全部胃液抽出置于离心管中离心，3 000 r/min,20 min取上清液，用0.1 mol/l naoh溶液滴定测量胃液的总酸度。
2.5 统计学处理
采用统计软件spss11.0分析，实验数据均以±s表示，用t检验处理，p<0.05为有统计学差异。
3 结果
3.1 健脾活血药物对胃溃疡大鼠壁细胞胃泌素受体结合容量的影响 溃疡大鼠壁细胞胃泌素受体结合容量明显低于正常大鼠(p<0.01)，奥美拉唑组、健脾活血组及中西治疗组结合位点数明显回升，与溃疡组比较有非常显著性差异(p<0.01)，奥美拉唑组结合位点数与正常组比较升高，有显著性差异(p<0.05)。见表2。表2 大鼠离体壁细胞胃泌素受体结合位点数（略）
3.2 健脾活血药物对胃溃疡大鼠胃液总酸度及壁细胞h+，k+-atp酶活性的影响
溃疡模型组大鼠胃液总酸度较正常对照组明显升高(p <0.01),壁细胞h+，k+-atp酶活性亦明显升高(p<0.01)；奥美拉唑组大鼠胃液总酸度较正常对照组降低(p<0.05),壁细胞h+，k+-atp酶活性亦下降(p<0.05)；健脾活血组大鼠胃液总酸度较正常对照组升高(p<0.05),壁细胞h+，k+-atp酶活性亦升高(p<0.05)；中西治疗组与正常组比较，其总酸度及h+，k+-atp酶活性无明显差异（p>0.05）。结果见表3。表3 各组胃液总酸度及壁细胞h+，k+-atp酶活性的测定结果（略）
4 讨论
胃泌素是与胃酸分泌功能密切相关的激素，由胃窦g细胞所分泌，作用于壁细胞膜上的胃泌素受体（壁细胞是胃泌素的主要靶细胞），而促使胃壁细胞的泌酸作用。胃泌素可直接作用于细胞而促进胃肠道粘膜的生长作用（特别是胃泌酸区粘膜）和刺激胃肠胰蛋白质、rna、dna合成增加，维持胃黏膜的完整性，是胃粘膜的主要保护因子之一［3］；另一方面又能作为胃酸分泌的主要刺激因子而刺激酸分泌。胃泌素与其受体的正常结合和受体的良好介导是壁细胞泌酸功能得以正常发挥的前提和保证［4，5］。
胃泌素的生物学效应由胃泌素受体介导，壁细胞膜上胃泌素受体水平直接影响到胃酸的分泌的性质，因此，单纯研究胃泌素水平的意义是有限的，还需要结合胃泌素受体、受体后信号转导的变化规律研究。
h2受体拮抗剂、质子泵抑制剂的使用，胃腔内ph值的升高，可以反馈性地刺激胃泌素分泌增加，在高血清胃泌素水平的作用下，肠嗜铬样细胞（ecl cell）激活与增殖，分泌过多的组胺，一起作用于胃壁细胞产生反跳性酸分泌增加［6～9］；同时，胃壁细胞h+, k+-atp酶活性被抑制，反刺激胃壁细胞膜上过多地表达胃泌素受体等因素，使胃壁细胞对胃泌素等激素的敏感性增加，给停药后胃酸的控制、远期疗效的保障、防治疾病的复发等方面带来一定的困难［10～13］。
中医药与中西医结合对防治消化性溃疡复发与保证其远期疗效有较好的效果。中医认为消化性溃疡多因外感寒邪、饮食不节、情志不遂，寒、热、虚、郁皆致气机郁滞，而致血瘀，瘀久络伤，致溃疡而痛，病本虚标实，虚实夹杂，且往往病程日久，久病入络，致虚致瘀，证候多表现为脾虚血瘀，所以治疗上多采用益气健脾、扶正祛瘀、标本兼顾之法，才能确保溃疡的远期疗效［14～17］。
本课题中，单纯用奥美拉唑治疗，壁细胞胃泌素受体结合位点数明显高于正常大鼠，胃液总酸度及h+, k+-atp酶活性明显降低；健脾活血药物治疗，壁细胞胃泌素受体结合容量低于正常大鼠，胃液总酸度及h+, k+-atp酶活性升高；健脾活血与奥美拉唑治疗组，壁细胞胃泌素受体结合容量、胃液总酸度及h+, k+-atp酶活性与正常大鼠比较无显著性差异。推测健脾活血中药通过对平缓地抑制胃壁细胞的h+, k+-atp酶活性，降低胃酸的分泌；同时，不影响胃泌素水平，可保证胃泌素的正常胃粘膜营养作用，不刺激胃泌素及胃壁细胞膜上胃泌素受体水平增多等作用，防止停药后反跳性过多泌酸。
【参考文献】
［1］梅武轩，邓兰琼，崔世高．柴胡桂枝汤对大鼠乙酸胃溃疡愈合质量的影响［j］．中国中西医结合脾胃杂志，2000，8(5)：278.
［2］聂 克, 王汝俊, 王建华. 大鼠胃壁细胞的分离方法［j］. 世界华人消化杂志， 1999，7:994.
［3］schmassmann a, reubi jc. cholecystokinin-b/gastrin receptors enhance wound healing in the rat gastric mucosa［j］. j clin invest, 2000, 106(8):1021.
［4］孙凤蓬, 宋于刚, 高天明. 壁细胞酸分泌的调节［j］．世界华人消化杂志，2002，10:1450.
［5］xiao x, forte jg. cell biology of acid secretion by the parietal cell［j］. annu rev physio，2003，65:103.
［6］gomollon f, calvet x. optimising acid inhibition treatment［j］. drugs, 2005, 1:25.
［7］fossmark r, johnsen g, johanessen e, et al. rebound acid hypersecretion after long-term inhibition of gastric acid secretion［j］. aliment pharmacol ther, 2005, 21(2):149.
［8］qvigstad g, waldum h. rebound hypersecretion after inhibition of gastric acid secretion［j］. basic clin pharmacol toxicol, 2004, 94(5):202.
［9］el-omar em. mechanisms of increased acid secretion after eradication of helicobacter pylori infection ［j］. gut, 2006, 55(2):144.
［10］gillen d, mccoll ke. problems associated with the clinical use of proton pump inhibitors［j］. pharmacol toxicol. 2001, 89(6):281.
［11］jensen rt. consequences of long-term proton pump blockade: insights from studies of patients with gastrinomas［j］. basic clin pharmacol toxicol, 2006, 98(1): 4.
［12］katagiri f, inoue s, itoh h, et al. omeprazole raises somatostatin and motilin in human plasma［j］. biol pharm bull, 2005, 28(2):370.
［13］steel k. gastrin and gastrin receptor ligands - a review of recent patent literature［j］. drugs, 2002, 5(7):689.
［14］黄绍刚，周福生，黄穗平，等．消化性溃疡发病与复发的中医病机探微［j］．新中医，2005，37(3)：6.
［15］吴芳，易受乡．中医药对胃黏膜损伤保护作用机理研究进展［j］．中国中医药信息杂志，2003，10(12)：76.
［16］唐梅文，王庆高，罗伟生，等．溃疡愈合质量的影响因素与中医药干预的研究进展［j］．广西中医药，2004，27(3)：7.
［17］刘建平，王文智，白建乐，等．中医药提高消化性溃疡愈合质量研究近况［j］．山东中医杂志，2003，22(6)：381.
