作者：毛春谱，李小毅，张红梅，林桂芬，李伟
【摘要】 目的观察转化生长因子β1(tgf-β1)及ⅳ型胶原（co-ⅳ）在糖尿病大鼠肾组织中的表达及灵芝多糖干预后的影响。方法腹腔注射链脲佐菌素（stz）诱导大鼠造成糖尿病模型，分组予不同剂量灵芝多糖（glp）进行治疗性灌胃。8周后，用免疫组化方法和rt-pcr方法检测各组大鼠肾皮质tgf-β1、co-ⅳ的蛋白和mrna表达。结果糖尿病组大鼠肾小球tgf-β1、co-ⅳ蛋白和mrna表达较正常对照组明显升高（p＜0.01）；灵芝多糖各组较糖尿病组表达降低（p＜0.01）。结论灵芝多糖可能通过下调糖尿病大鼠肾脏中tgf-β1和co-ⅳ的表达，减少细胞外基质积聚，起到对糖尿病大鼠肾脏保护作用。
【关键词】 灵芝多糖； 糖尿病肾病； 转化生长因子β1； ⅳ型胶原
abstract：objectiveto investigate the expressions of transforming growth factor-beta1(tgf-β1) and type ⅳ collagen(co-ⅳ) in the kidney of diabetic rats and the effects of ganoderma lucidum polysaccharides（glp）on such changes.methodsdiabetic rat model was induced by streptozocin（60mg/kg）and the rats were divided into 5 groups randomly and treated with different dose glp.8 weeks later，the expression of tgf-β1 and co-ⅳ in kidney tissue was determined by immunohistochemistry and rt-pcr methods.resultscompared with group c ，the expressions of protein and mrna tgf-β1、co-ⅳ significantly increased in glomeruli（p＜0.01）.the abnormal expressions of these proteins、mrna were dramatically improved in diabetic rats by glp treatment（p＜0.01）.conclusionglp has some renalprotective effect on diabetic rats，through inhibition of excessive deposition of glomeruli extracellular matrix by inhibiting the expression of tgf-β1 and decreasing the synthesis of co-ⅳ.
key words：ganoderma lucidum polysaccharides； diabetic nephropathy； transforming growth factor-β1； type ⅳ collagen
随着人们生活水平的提高和人口的老龄化，糖尿病的发病率逐年升高。Www.11665.COm糖尿病肾病（diabetic nephropathy，dn）是糖尿病最重要的慢性微血管并发症之一，也是糖尿病主要的死亡原因之一。目前，单纯西药尚不能有效阻止糖尿病肾损害的自然进程，灵芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，为滋补强壮，扶正固本的珍品，它的有效成分非常丰富，主要有灵芝多糖（ganoderma lucidumpolys accharides，glp）、三萜类化合物、灵芝酸、腺苷等，其中glp是最有效的活性成分之一。灵芝的药理活性大多和glp有关，其具有广泛的药理活性［1］，能提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，消除自由基，抗氧化［2］，抗辐射和降低血脂［3］等作用，但对dn的作用报道很少。本研究采用免疫组化和rt-pcr方法观察灵芝多糖不同剂量组对糖尿病大鼠肾组织的转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，tgf-β1）和ⅳ型胶原（type ⅳ collagen，co-ⅳ）的表达变化，旨在探讨glp对dn的保护机制［4～10］。
1 材料与仪器
清洁级雄性sd大鼠50只， 体质量180～220g（徐州医学院实验动物中心）。stz（美国sigma公司），灵芝多糖（河北保定施达科生物工程技术有限公司，批号：rm051215）。一抗分别为兔抗大鼠tgf-β1、co-ⅳ抗体、sp-6001试剂盒及dab试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），total rna提取试剂、rt-pcr 试剂盒（大连宝生物有限公司）。leica qwin图像处理与分析系统（德国）， 罗氏血糖仪（上海罗氏公司），日立7600型全自动生化分析仪检测（日本日立公司）。
2 方法
2.1 糖尿病模型的建立和实验分组 将50只sd大鼠随机分为：正常对照组（c组，n＝10），糖尿病组未治疗组（dm组，n＝10），灵芝多糖低剂量组（glp-1组，n＝10），灵芝多糖中剂量组（glp-2组，n＝10），灵芝多糖高剂量组（glp-3组，n＝10），分笼饲养。dm组和glp-1、glp-2、glp-3组大鼠在禁食12 h后，于左下腹腔一次性注射stz（溶于0.1 mmol/l柠檬酸缓冲液，ph 4.4）60 mg/kg，72 h后，尾静脉采血测随机血糖≥16.7 mmol/l，持续3 d以上作为模型纳入本实验。c组仅予以等量柠檬酸缓冲液腹腔注射。40只大鼠经检测均造模成功。模型成立3 d后glp-1、glp-2、glp-3组分别给予灵芝多糖水溶液100，200，400 mg/kg剂量进行治疗性灌胃，c组和dm组用等体积生理盐水灌胃。所有大鼠实验期间自由饮水进食，不使用胰岛素及其他降糖药物。每隔1周测量体质量（body weight，bw）以调整用药量。
2.2 标本收集连续观察 8周后收集标本。代谢笼中收集24 h尿，离心保存于－20℃的冰箱待测尿微量白蛋白（uaer）。称量体质量后，用10％水合氯醛麻醉，腹主动脉采血测血糖（bg）、糖化血红蛋白（hba1c）、尿素氮（bun）、血肌酐（scr）、总胆固醇（tc）、甘油三酯（tg）。用4℃冰冷生理盐水灌洗后摘除双肾，去包膜滤纸吸干血迹后称重左肾，左肾重（kw）和体质量的比值作为肾脏指数（ki）的指标。取肾皮质置于10％中性福尔马林中固定，以备光镜、免疫组织化学研究；余肾皮质置depc水处理过的ep管，液氮冻透后保存于-70℃的冰箱待测rt-pcr。
2.3 生化指标的测定bg采用葡萄糖氧化酶法检测，uaer采用胶体金双抗体夹心法检测，hba1c采用亲和层析法检测，bun、scr、tc、tg由日立7600型全自动生化分析仪检测。
2.4 常规光镜检测肾组织经10％福尔马林固定，常规脱水、包埋，切片厚4um，行he染色和免疫组化。
2.5 免疫组化研究采用sp二步法，石蜡切片厚4 μm后常规脱蜡至水，3％h2o2阻断内源性过氧化物酶后，微波加热暴露抗原， 滴加一抗tgf-β1（1∶100）、co-ⅳ（1∶120），4℃冰箱过夜，pbs洗片后滴加二抗，37℃孵育1 h，dab显色控制在3～5 min，复染、脱水、透明、封片。以吸光度值（a）表示，显色强度用leica qwin图像处理与分析系统进行分析，以每张切片随机取10个视野的肾小球进行半定量分析。
2.6 rt-pcr研究由基因库分别查得大鼠tgf-β1、co-ⅳ及β-actin的mrna核苷酸序列，pcr引物用primer premier引物设计软件设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（见表1）。表1 大鼠转化生长因子-β1 ( tgf-β1 ) 、co-ⅳ及β-actin 引物序列（略）
取肾皮质100 mg，加液氮研碎后，用trizol (大连宝生物工程有限公司)提取总rna。提取的总rna测od值：od260/od280值在1.8～2.0之间。分别取1 μg总rna以amv l (大连宝生物工程有限公司)为逆转录酶作逆转录反应，cdna产物保存于- 20℃。优化pcr扩增条件，使pcr扩增在对数期内进行。分别进行tgf-β1 、co-ⅳ与β-actin 扩增。在dna扩增仪(eppendorf mastercyler gradient) 上进行pcr扩增。tgf-β1 的反应参数为94℃ 2 min，94℃ 45 s、62℃ 45 s、72 ℃45 s共35个循环；co-ⅳ的反应参数94℃ 2 min，94℃ 45 s、64℃ 45 s、72℃ 45 s共35个循环；β-actin反应参数为94℃ 2 min，94℃ 45 s、57℃ 45 s、72℃ 45 s共35个循环。取pcr扩增产物5μl在1.5%琼脂糖中电泳，imagemaster vds 成像系统摄影存盘后应用计算机图像分析软件(totallabv 1. 01) 行灰度扫描分析。以目的基因与β-actin 的pcr产物条带灰度volume之比作为反映目的基因mrna水平的相对指标。
2.7 统计学处理计量资料用±s表示， 应用spss 13.0统计软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析。
3 结果
3.1 一般情况和常规生化指标dm组大鼠在实验期间多饮、多尿、多食、体质量减轻、毛色无光泽、生长发育迟缓等症状十分明显。8周时dm组与c组相比，bg，ki，hba1c，uaer显著升高，而kw明显下降（p<0.01），scr，bun，tc，tg各组差异无统计学意义，glp各组治疗后bw增加，ki降低， uaer指标明显改善，尤以灵芝多糖高剂量组明显（p<0.01），但bg、hba1c差异无统计学意义。结果见表2。表2 灵芝多糖对糖尿病大鼠血生化指标、肾脏指数及尿微量白蛋白的影响（略）
3.2 一般形态学改变dm组大鼠较c组系膜细胞显著增生，系膜基质增多，肾小动脉内膜增生，管壁增厚，毛细血管腔狭窄，glp各组较dm组上述病理改变有不同程度改善。
3.3 免疫组化结果免疫组化染色显示阳性颗粒主要定位于肾小球和肾小管：dm组较c组比较，tgf-β1、co-ⅳ棕黄色颗粒染色强度明显升高，染色面积增多(p<0.01)；glp各组较dm组相比均不同程度降低(p< 0.01)。结果见表3及图1。
3.4 rt-pcr结果8周时，与c组相比，dm组tgf-b1mrna、 co-ⅳmrna表达增多；与dm组相比，glp各组tgf-b1mrna、 co-ⅳmrna表达减少(p< 0.01)，见表3及图2。表3 灵芝多糖对各组糖尿病大鼠tgf-β1和co-ⅳ表达的影响（略）
4 讨论
本实验结果表明stz诱导的糖尿病大鼠模型，8周后大鼠出现毛色无光泽、生长发育迟缓等症状，bg、ki、hba1c、uaer显著升高，病理上肾小球系膜细胞显著增生，系膜基质增多，肾小动脉内膜增生，管壁增厚，毛细血管腔狭窄，提示已出现dn早期表现。glp给药8周后糖尿病大鼠bw增加、ki降低，uaer指标明显改善，肾脏病理损害得到不同程度的改善，呈现剂量依赖趋势，尤以灵芝多糖高剂量组明显。但对bun、scr、tc、tg无影响，这可能与糖尿病大鼠模型时间较短，尚未出现全面的代谢紊乱有关。
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