作者：阳美平,尹莲,张旭,吴皓,孙怡,段金廒
【摘要】 目的 研究周氏克金岩方治疗肺癌的物质基础。方法 用醇沉法提取周氏克金岩方多糖,采用sevag法纯化,deae纤维素阴离子交换树脂制备多糖组分,紫外光谱检测蛋白存留情况,红外光谱分析组方药的归属,采用蒽酮-硫酸比色法测定多糖组分含量。结果 该有效多糖组分在240 nm和260 nm处无吸收,其红外光谱图与组方药玉竹、猫爪草和仙鹤草的红外光谱图有很大的相似性,周氏克金岩方中该多糖组分含量为1.41%。结论 抗a549肺癌细胞多糖组分不含蛋白和核酸,来源于组方药玉竹、猫爪草和仙鹤草,周氏克金岩方中含有一定量的多糖组分。
【关键词】 周氏克金岩方；多糖；抗肺癌a549细胞活性
abstract：objective to study content and ascription of the composition of the polysaccharides from zhou’s prescription for resolving mass. method the polysaccharide was extracted by ethanol precipitation, and purified by savage method. deae-cellulose anion exchange resin was used to prepare the composition of polysaccharides. uv-spectra was used to detect protein and ir-spectra was used to analyses the ascription of the composition of polysaccharides. the content of the composition of polysaccharides was determined by anthranone-sulfuric acid method. result there was no absorption at 240 nm and 260 nm. the ir spectrum graph of the polysaccharides was similar to polygonatum odoratum, radix ranunculi ternati and agrimonia pilosa ledeb. the content of the composition of polysaccharides was 1.41%. conclusion the composition of polysaccharides does not contain proteins and nucleic acids, and come from polygonatum odoratum, radix ranunculi ternati and grimonia pilosa ledeb.
key words：zhou’s prescription；polysaccharides；anti-lung cancer of a549
周仲瑛抗肺癌有效经验方又名周氏克金岩方,由沙参、麦冬、猫爪草、仙鹤草、红花、玉竹等药组成。WwW.11665.cOm其在改善肺癌患者临床症状、稳定瘤体、防止复发、提高生活质量等方面均有良好的作用。前期研究已筛选出周氏克金岩方抗肺癌a549细胞多糖有效组分,本试验旨在对该多糖组分进行组方药归属分析和含量测定,为深入研究该方抗肺癌物质基础提供依据。
1 仪器与试药
uv-2401紫外分光光度计；fa1104n型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；ir-435红外光谱仪(日本岛津)。蒽酮(分析纯、国药集团化学试剂有限公司),浓硫酸(上海化学试剂有限公司)；deae(oh-1)纤维素(上海恒信化学试剂有限公司)；乙醇、正丁醇、三氯甲烷等试剂为分析纯。葡萄糖(中国药品生物制品检定所)；麦冬、沙参、猫爪草、仙鹤草、红花、玉竹等均购自于安徽铜陵中药饮片有限公司。
2 方法与结果
2.1 样品的制备
2.1.1 复方多糖成分的提取
全方药材粗粉用水浸泡1 h,然后煮沸1 h,过滤,收集滤液,共提取3次。合并滤液、浓缩,将浓缩后的滤液加乙醇至含醇量达70%,离心,弃去上清液,沉淀用蒸馏水溶解,采用sevag法除去蛋白,用氯仿-正丁醇(5∶1)萃取多糖水溶液,静置后弃去中间变性蛋白层,反复多次,直到蛋白除尽为止。将上层水液浓缩至干燥,即为复方多糖提取物。
2.1.2 多糖组分的精制
取部分“2.1.1”项下的多糖提取物溶于蒸馏水,上deae纤维素柱(oh-型),收集0.15 mol/l nacl洗脱液,透析脱盐,浓缩干燥,即得精制多糖组分。
2.1.3 单味药材多糖成分的制备
分别取麦冬、沙参、玉竹、猫爪草、仙鹤草等按“2.1.1”项下的操作方法制得单味药材多糖提取物。
2.1.4 葡萄糖标准品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的葡萄糖0.038 5 g,用蒸馏水定容到25 ml,得1.54 mg/ml葡萄糖标准液。
2.1.5 多糖组分贮备液的制备
取“2.1.2”项下制得的精制多糖组分3 mg,精密称定,用蒸馏水定容至25 ml,作为多糖组分贮备液。
2.1.6 复方多糖供试液的制备
取“2.1.1”项下制得的复方多糖提取物0.101 36 g,精密称定,置25 ml容量瓶中,稀释至刻度,作为复方多糖供试液。
2.2 多糖组分的定性分析
2.2.1 紫外扫描分析
取多糖组分适量,加0.9%nacl溶液溶解,配成浓度为5 mg/ml的溶液,在200～400 nm范围内扫描,结果表明,在240 nm和260 nm处无吸收,表明该多糖不含核酸和蛋白质。
2.2.2 红外光谱分析
分别取精制多糖组分及单味药多糖2 mg,与400 mg干燥的溴化钾混匀,在玛瑙研钵中研磨5～10 min,压片,在红外光谱仪上测定。结果表明,精制多糖组分在3 400/cm和2 930/cm处的宽峰分别为多糖的o-h键和c-h键引起的吸收,在880/cm处的吸收表明此多糖存在β型糖苷键。
多糖组分与组方药单味药多糖的红外光谱对比表明,玉竹、猫爪草、仙鹤草多糖与复方多糖组分红外图谱及特征吸收峰有很大的相似性。3个单味药多糖除了在2 930、3 400/cm处的特征吸收外,2 350、1 620、1 420、1 020/cm特征吸收峰均与多糖组分相似,由此初步推断,该复方多糖组分来源于这3味药材。
2.3 多糖含量测定方法学考察
2.3.1 最大吸收波长的确定
分别精密吸取“2.1”项下葡萄糖标准液、多糖组分标准贮备液、复方多糖供试液各1 ml至具塞试管中,以蒸馏水作空白,分别加0.2%蒽酮-硫酸试剂4.0 ml,摇匀后迅速置于冰浴中,冷却后,一起浸入沸水浴中加热7 min,取出后冷却至常温,用uv-2401紫外分光光度计在200～800 nm处扫描[1]。各溶液在599 nm处均有最大吸收峰,由此确定检测波长为599 nm。
2.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制
精密吸取“2.1.4”项下的葡萄糖标准溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 ml分别置于25 ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度线,制成系列标准溶液。按“2.3.1”项下方法在599 nm处测吸光度,以吸光度(y)对葡萄糖浓度(x)作回归处理,得回归方程：y＝9.485 9x＋0.003 9(r2 ＝0.998 3),线性范围为0.018 48～0.092 40 mg/ml。
2.3.3 转换因子的测定
精密吸取“2.1.5”项下的多糖组分贮备液1 ml,按“2.3.1”项下方法测定吸光度,求出多糖液中相当于葡萄糖的浓度(c)。按下式计算换算因子：f＝w/c·d。其中w为多糖重量(mg),d为多糖稀释因素(ml),测得f＝3.35。
2.3.4 稳定性考察
精密称取一定量的“2.1.6”项下的复方多糖供试液,置于25 ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,按“2.3.1”项下方法操作,测定0、5、10、30、60 min时的吸光度,结果表明该方法在1 h内稳定,rsd＝0.75%。
2.3.5 精密度试验
连续精密称取同一份复方多糖样品0.05 g置25 ml容量瓶中,稀释至刻度,精密吸取1 ml,按“2.3.1”项下方法操作,进行测定,结果表明精密度较高,rsd＝4.06%。
2.3.6 加样回收率考察
取“2.1.1”项下制得的复方多糖2.027 mg,分别加入不同量的多糖组分,置于25 ml容量瓶中,稀释至刻度,精密吸取1 ml,按“2.3.1”项下方法进行测定,结果表明,平均回收率为98.07%,rsd＝1.71%。说明该测定方法准确可行。
2.4 复方多糖组分的含量测定
取“2.1.1”项下制得的复方多糖提取物0.253 4 g(全方原药材量4.759 g),定容至25 ml,取5 ml再定容至25 ml,精密吸取1 ml,按“2.3.1”项下方法测吸光度,按公式：含量(%)＝c×d×f×100/w计算该方中多糖组分含量。其中：c为样品液的葡萄糖浓度(mg/ml),d为样品液的稀释因素(ml), f为转换因子,w为原药材重量(mg)。测得复方中多糖组分的含量为1.41%,结果见表1。表1 复方多糖的含量测定结果（略０
3 讨论
复方中组方药材较多,多糖种类也较复杂,标准多糖难以确定,多数方法是选取复方中某单味药材多糖为标准测定换算因子,其含量分析结果缺乏准确性。本试验是在明确抗肺癌a549细胞多糖组分的研究基础上,以它作为标准多糖测定复方有效多糖含量,可为复方多糖含量的测定方法提供参考,其测定结果准确,具有实际意义。
周氏克金岩方中猫爪草软坚散结,仙鹤草活血化瘀,玉竹益气养阴。本研究结果表明,来源于这3味药的多糖组分具有抗肺癌a549细胞的活性。周氏克金岩方中含多糖的组方药较多,本研究利用红外光谱及其特征吸收峰,初步判断抗a549肺癌细胞多糖组分的组方药归属,为进一步控制多糖提取物质量、深入研究该多糖组分结构及抗肺癌作用机制提供了依据。
【参考文献】
[1] 张妙霞,孔祥生,郭秀璞,等.蒽酮-硫酸法测定可溶性糖显色条件研究[j].洛阳农专学报,1997,17(4)：24－28.
