作者：李玉萍，曾宪伟 ，叶军，苏虎 ,刘华，周春丽
【摘要】 目的观察马齿苋活性成分对人肺腺癌细胞系(a-549 cell)、人喉表皮样癌细胞系(hep-2 cell)、人宫颈癌细胞系(hela cell)和人恶性胚胎横纹肌瘤细胞系（rd cell）生长的影响。方法体外培养条件下用不同浓度的马齿苋活性成分处理4种癌细胞，通过溴化二甲噻唑二苯四氮唑（mtt）试验法测定癌细胞的增殖；同时处理s180荷瘤小鼠，观察荷瘤小鼠的体重、瘤重、死亡率和抑瘤率。结果马齿苋生物碱对离体培养的a-549肺癌细胞、hela细胞和hep-2细胞的增殖均具有明显抑制作用,马齿苋多糖对hela细胞有较强的抑制作用, 马齿苋脂肪酸对hep-2细胞有一定的抑制作用，马齿苋黄酮对rd细胞有很强的抑制作用，并存在浓度剂量效应，高浓度抑制作用强。结论马齿苋活性成分能选择性地杀伤癌细胞，有进一步研究的潜在价值。
【关键词】 马齿苋； 活性成分； 溴化二甲噻唑二苯四氮唑试验； 抗肿瘤活性
abstract：objectiveto observe the effects of the active constituents from portulaca oleracea l. on the proliferation of four human tumor cell lines. methodsthe anti-proliferation activities of active constituents from portulaca oleracea l. upon a549 cell, hela cells, hep-2 cell and rd cell were analyzed by mtt in vitro．body weigt, tumor weigt, inhibition rate and death rate of these active constituents from portulaca oleracea l. on the transplanted tumor cells of sarcinoma 180 were observed in mice.resultsraw screening of the four compounds by mtt indicated polysaccharides, flavonoids, alkaloids and polyunsaturated fatty acid exerted obvious suppression on the proliferation of tumor cell lines in a dose dependent manner, respectively. the experiments in vivo indicated that the four active constituents had certain inhibition against the cells of implanted tumor ascites sarcinoma 180. conclusionthe active constituents from portulaca oleracea l. have selective cytotoxicity to the tumor cells and is worthy of further investigation.
key words：portulaca oleracea l.; active constituent; mtt assay; antitumor effect
恶性肿瘤是目前危害人们生命和健康的严重疾病之一，而化学合成的抗癌药常常对人体正常细胞产生毒副作用，因此从天然动、植物中寻找毒性低、疗效高的抗癌活性成分仍是近年来国内外科学工作者研究的热点之一。Www.11665.com药食两用植物马齿苋含有去甲基肾上腺素、生物碱、香豆精类、黄酮类、多糖、多不饱和脂肪酸等活性成分［1］，其中马齿苋多糖具有抗癌作用已被报道［2，3］。为了探讨马齿苋其它活性成分的抗癌作用，本实验对马齿苋总提取液、多糖、总黄酮、生物碱、不饱和脂肪酸等活性成分进行了体内和体外抗癌作用实验研究, 对马齿苋活性成分的抗癌活性进行初步筛选，为进一步系统研究马齿苋的药用价值提供理论依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器与试剂rpmi 1640培养液：美国gibco公司产品；胎牛血清（fbs）：杭州四季青生物工程有限公司产品； 溴化二甲噻唑二苯四氮唑 (mtt)、胰蛋白酶和二甲基亚砜(dmso)为amresco公司产品；其余试剂均为国产分析纯(国药集团)。倒置荧光显微镜(ix-71)：日本olympus产品；二氧化碳培养箱(thermo forma series-ii，美国 thermo scientific，forma公司)产品；全自动酶标仪(multiscan mk3, labsystems公司)产品。
1.2 材料新鲜马齿苋portulaca oleracea l.于2005-09购于江西省南昌市农贸市场，经本校药学院药理学教研室鉴定。用清水洗净，沥干水分，60℃鼓风干燥6 h，粉碎备用。称取上述备用马齿苋干粉50 g，加蒸馏水（按1∶30的比例分3次加蒸馏水），煮沸后煎20 min，取其上清液减压浓缩使其生药浓度为2 g/l，得粗提取液，置4℃冰箱保存备用。同时，称取相同重量的马齿苋干粉，分别采用周晶［4］、上官新晨［5］、黄阿根［6］等的方法提取马齿苋粗多糖、不饱和脂肪酸、生物碱、黄酮及定量，所得样品4℃干燥保存备用。临用时配制使用。
2 方法
2.1 细胞株及体外抑瘤作用观察
2.1.1 肿瘤株选用人肺腺癌细胞(a-549 cell)和人宫颈癌细胞(hela cell) 由南昌大学医学院第二附属医院细胞研究室友情提供，人喉表皮样癌细胞(hep-2 cell)和人恶性胚胎横纹肌瘤细胞（rd cell）由江西省疾控中心友情提供。
2.1.2 马齿苋活性成分对a-549 细胞生存能力的影响选对数生长期的a-549细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，用含10％fbs的rpmi1640培养液制成5×104个细胞/ ml，接种于96孔板中培养24 h后， 吸去上清液。阴性对照组加入同体积的未添加马齿苋活性成分的培养液；实验组分别加入含有终浓度为10， 50， 100， 200 μg/m1的总提取液、多糖、不饱和脂肪酸、生物碱、黄酮的培养液处理4 h后，更换培养液继续培养24 h，采用mtt法间接测定癌细胞生存能力［7］，按公式计算其抑瘤率。抑瘤率(％)=［(对照组a值一实验组a值)／对照组a值］×100%。
2.1.3 马齿苋活性成分对hep-2细胞、hela细胞和rd细胞的作用实验方法与“2.1.2”项基本相同，不同之处是：取指数生长期的hep-2 cell、rdcell和hela cell，用含10% fbs的dmem培养液配制成1×105个细胞/ml悬液，接种于96孔板中，随后的处理同“2.1.2”项。
2.2 实验动物及体内抑瘤作用观察
2.2.1 实验动物及瘤株昆明种小鼠，雌雄各半，5周龄，体质量19～23 g，由江西省医学实验动物中心提供(合格证号：021-97-03)，一级动物。实验小鼠肉瘤s180腹水型瘤株由江西省医学实验动物中心提供。
2.2.2 小鼠s180实体瘤模型建立与分组s180肉瘤细胞接种选择接种s180细胞后1周的小鼠脱颈椎处死，无菌条件下抽取腹水，用生理盐水调节细胞浓度至1×107 个细胞/ml。以每只小鼠0.2 ml接种于小鼠右腋下皮下。将动物随机分为6组，每组6只，其中一组为阴性对照组，其余5组为实验组。
2.2.3 马齿苋活性成分对小鼠s180移植性实体瘤的影响阴性对照组每日腹腔给予等量的生理盐水（0.2 ml/d），实验组分别每日腹腔给予100 mg/kg·b.w.的马齿苋总提取液、多糖、总黄酮、生物碱和不饱和脂肪酸。接种肿瘤24 h 后给药，连续14 d，分别于实验开始和实验结束时称小鼠体重并记录。实验结束后，脱颈椎处死小鼠剥离肿块，称瘤重，并计算肿瘤生长抑制率。
2.3 统计学处理实验结果以±s表示，计量资料用方差分析法分析，用t检验统计处理。p<0.05被认为两变量之间有统计学显著性差异。
3 结果
3.1 马齿苋活性成分对a549细胞的抑制作用结果见表1。终浓度为100 μg/ml和200 μg/ml的马齿苋生物碱对a549肺癌细胞的增殖具有明显抑制作用，抑制率分别为15%和28%，与对照组相比均有显著性差异，呈现浓度依存性抑制关系。马齿苋总成分、多糖、脂肪酸和黄酮各剂量组对a549细胞无明显的抑制作用。表1 马齿苋活性成分对a549细胞体外增殖的影响（略）
3.2 马齿苋活性成分对hela细胞的抑制作用马齿苋多糖和生物碱对宫颈癌hela细胞均有较强的抑制作用，终浓度为100μg/ml和200μg/ml的马齿苋多糖对hela细胞增殖的抑制率约为18%～30%，而马齿苋生物碱对hela细胞增殖的抑制率约为35%，且与药物浓度呈正相关（见表2）。表2 马齿苋活性成分对hela细胞体外增殖的影响（略）
3.3 马齿苋活性成分对hep-2细胞的抑制作用马齿苋脂肪酸和生物碱对hep-2细胞体外增殖有一定的抑制作用，有随着浓度的增加抑制作用增强的趋势。但马齿苋黄酮对hep-2细胞没有抑制作用。相反，在10～100 μg/ml浓度范围内，有促进hep-2细胞增殖的作用见表3。表3 马齿苋活性成分对hep-2细胞体外增殖的影响（略）
3.4 马齿苋活性成分对rd细胞的抑制作用马齿苋黄酮对rd细胞体外增殖有很强的抑制作用，其抑癌效果与剂量呈正相关，在终浓度达200 μg/ml时，抑制率达50%。但马齿苋总成分、多糖、脂肪酸和生物碱对rd细胞没有显著抑制作用。见表4。表4 马齿苋活性成分对rd细胞体外增殖的影响（略）
3.5 马齿苋活性成分对小鼠肿瘤生长的抑制作用马齿苋活性成分对小鼠s180移植性实体瘤的影响由表5可以看出，各活性成分对肉瘤均有一定的抑制作用，各成分处理组小鼠平均瘤重均明显低于对照组(p<0.01，p<0.001)，其中黄酮抑制作用最强，达38%。同时，荷瘤小鼠的死亡率得到明显抑制，生理盐水处理组小鼠在实验结束时小鼠死亡率为50%，马齿苋生物碱、黄酮、多糖、脂肪酸和总成分提取液处理组小鼠15 d后的死亡率分别为0，16.7%，16.7%，33.3%和33.3%（见表5）。整个实验过程中不伴有体质量降低或其它副作用现象出现。表5 马齿苋活性成分对小鼠肿瘤生长的抑制作用（略）
4 讨论
近年来资源丰富，有效低毒的植物多糖作为抗肿瘤活性物质已成为人们研究的热点。马齿苋多糖体外实验对人肝癌细胞株smmc7721［2］和bel-740［3］的增殖具有一定的抑制作用，但对小鼠结肠癌细胞株cocon-26无明显的抑制作用［3］，提示马齿苋多糖的抗癌作用具有选择性。本次实验结果表明，马齿苋多糖可抑制hela肿瘤细胞增殖，但对a-549细胞、hep-2 细胞和rd细胞无明显的抑制作用，再次证明了马齿苋多糖对肿瘤细胞株的直接抑制作用具有选择性。其抑瘤作用的机制可能与增强免疫功能和提高抗氧化能力有关［2，3，8］。
对黄酮类化合物抗癌抗肿瘤作用的研究由来已久，本文首次报道了马齿苋黄酮类化合物对人恶性胚胎横纹肌瘤细胞rd体外增殖有很强的抑制作用，但对a-549、hela 和hep-2细胞没有明显的抑制效果，表明马齿苋黄酮类化合物对肿瘤细胞株的直接抑制作用具有选择性。其抗癌作用的机制可能与其具有自由基和抗氧化作用有关［9］。
近年来的研究发现多种植物生物碱具有抗肿瘤活性作用［10］。本实验首次发现马齿苋生物碱对人a-549、hela和hep-2细胞的增殖，以及荷瘤小鼠的肿瘤生长均具明显的抑制作用，但对rd细胞没有抑制效果，对瘤株的抑制作用具有广谱性和选择性。但其抗肿瘤作用的机理及抗瘤谱值得进一步深入研究。
早期研究发现多不饱和脂肪酸（pufa）具有抑制肿瘤细胞生长的作用，近期有学者认为不同种类pufa的作用也存在差异，n-3 pufa可抑制肿瘤生长，而n-6 pufa的作用则相反［11］。在本研究中，马齿苋脂肪酸（n-3 pufa）对hep-2细胞增殖有抑制作用，实验结果与有关n-3 pufa的报道一致［11］。
综上所述, 不同的活性成分对肿瘤细胞株的敏感性不同，具有明显的选择性。目前关于马齿苋活性成分为何对瘤株具有选择性和究竟是通过何种机制抑制肿瘤细胞的还不十分清楚，本课题组正进一步对其进行深入研究，期待为更好开发利用马齿苋活性成分提供更全面的理论依据。
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