【摘要】 目的建立知柏地黄丸的质量标准。方法采用tlc法对知柏地黄丸中的山茱萸、牡丹皮、黄柏、知母进行定性鉴别；hplc法测定知柏地黄丸中山茱萸中马钱苷的含量。结果薄层色谱鉴别专属性强。马钱苷线性关系良好,平均回收率符合规定。结论方法简便快速、结果准确，可有效控制知柏地黄丸的质量。
【关键词】 知柏地黄丸； 薄层色谱法 ； 高效液相色谱法； 质量标准
知柏地黄丸(浓缩丸)是由山茱萸、黄柏、知母、牡丹皮等8味中药组成的中药成方制剂，具有滋阴降火之功效，临床用于治疗阴虚火旺，潮热盗汗，口干咽痛，耳鸣遗精，小便短赤之症［1］。知柏地黄丸(浓缩丸)收载于卫生部药品标准，原标准项下除了收载的显微鉴别项和常规检查外，无其他检测项目［1］。方中山茱萸具有补益肝肾、涩精固脱等作用，其有效成分马钱苷测定的方法有高效液相色谱法［2～3］，胶束电动毛细管色谱法［4］。为了进一步完善该品种质量标准，本实验建立了高效液相色谱法测定知柏地黄丸中(浓缩丸)的马钱苷的含量测定方法，取得了较为满意的结果。现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 试剂与药材薄层色谱用硅胶g 、硅胶h、羧甲基纤维素钠（大连海洋化工厂）；丹皮酚对照品（批号：0708-9704），熊果酸对照品（批号：110742-200516），盐酸小檗碱对照品（批号：0713-9906）,菝契皂苷元对照品（批号：11074-200401），马钱苷对照品（批号：11640-200502）均由中国药品生物制品检定所提供,阴性样品由厂家提供。WwW.11665.Com甲醇、乙腈（色谱纯）；知柏地黄丸(河南宛西制药股份有限公司，批号050501,050502,050503)；其它试剂均为ar级。
1.2 仪器岛津lc-2010c高效液相色谱系统（日本岛津公司；包括：真空脱气机，四元梯度泵，自动进样器，dad二极管阵列检测器），solution色谱工作站（日本岛津公司）；fa2104电子天平（上海精密仪器科学有限公司）。
2 方法与结果
2.1 薄层色谱鉴别
2.1.1 牡丹皮取本品粉末15 g，加入乙醚20 ml，超声处理10 min，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮2 ml使溶解，作为供试品溶液。另取丹皮酚对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的对照品溶液。照薄层色谱法［5］试验,吸取上述两种溶液10 μl，点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚-甲苯-醋酸乙酯-盐酸(16∶8∶2∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.1.2 黄柏取本品粉末1 g，加入甲醇10 ml，超声处理15 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的对照品溶液。照薄层色谱法［5］试验,吸取上述两种溶液1 μl，点于同一硅胶g薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶1)为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
2.1.3 山茱萸取本品粉末5 g，加入醋酸乙酯20 ml，超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取熊果酸对照品，加无水乙醇制成每毫升含1 mg的对照品溶液。照薄层色谱法［5］试验,吸取上述两种溶液5μl，点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-醋酸乙酯-甲酸(20∶5∶8∶0.1)为展开剂，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.1.4 知母取本品粉末30 g，加入乙醚30 ml，超声处理10 min，滤过，弃去乙醚液，残渣挥尽乙醚后，加乙醇60 ml，加热回流1 h，滤过，滤液浓缩至20 ml，加盐酸2 ml，加热回流1 h后浓缩至约5 ml，加水10 ml，加石油醚（60～90℃）振摇提取2次，20 ml/次，合并石油醚液，用1％氢氧化钠溶液洗涤2次，20 ml/次，再用水洗涤2次，20 ml/次，分取石油醚液，蒸干，残渣加石油醚（60～90℃）1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取菝契皂苷元对照品，加石油醚（60～90℃）制成每毫升含1 mg的对照品溶液。照薄层色谱法［5］试验,吸取上述两种溶液10 μl，点于同一硅胶g薄层板上，以甲苯-丙酮(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以8％香草醛无水乙醇溶液与硫酸溶液（7→10）的混合溶液(0.5:5)，在100℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
2.2 含量测定
2.2.1 对照品溶液的制备精密称取马钱苷对照品,加80%甲醇制成每毫升含马钱苷30 μg的溶液,即得。
2.2.2 供试品溶液的制备取本品粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 ml，称定重量，超声处理（功率 250 w，频率 40 khz）20 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 阴性对照溶液的制备 取缺山茱萸的阴性样品适量，按供试品溶液的制备方法制备，即得。
2.2.4 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱：diamonsil c18（4.6 mm×250 mm，5 μm），ods预柱；四氢呋喃-乙腈-甲醇-0.05％磷酸溶液（1∶6∶4∶89）为流动相；检测波长236 nm；流速1.0 ml/min；柱温40℃；理论塔板数按马钱苷峰计算不低于4 500。
2.2.5 专属性试验照上述色谱条件，分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液20 μl，分别注入液相色谱仪。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照色谱在此保留时间无干扰，证明本法可行。结果见图1～3。
2.2.6 标准曲线与线性范围精密称取常温减压干燥24 h的马钱苷对照品10.13 mg，置25 ml量瓶中，用80%甲醇溶解并稀释至刻度，即得含马钱苷0.405 2 mg/ml的马钱苷对照品母液，并稀释成不同浓度的马钱苷对照品子液。结果表明马钱苷在0.040 52～4.052μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，其回归方程为y=2e+06x+5 664.1(r=1.000 0)。
2.2.7 进样重复性分别精密吸取对照品溶液20 μl，连续进样6次，测得峰面积的rsd<1.5％。
2.2.8 精密度实验
中间精密度：分别取供试品溶液在0，1，2，4，6，10，12 h，分别进样20 μl，测得峰面积的rsd<1.5％，表明供试品溶液较稳定。
重复性实验：取同一批供试样品，按样品测定项下方法，连续测定6次，测得含量结果的rsd<1.5％。表明样品重现性良好。
2.2.9 加样回收率实验精密称取已知含量的样品约0.25 g，分别定量加入对照品，照供试品溶液制备方法和样品项下的方法测定。结果见表1。
2.2.10 样品测定结果精密称取3批样品，制成供试品溶液，分别吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，依法测定，计算马钱苷含量，结果分别为0.774 2，0.779 5，0.776 4 mg/g (n=3) 。
表1 加样回收率实验结果（略）
3 讨论
有关山茱萸含量测定方法的研究颇多，主要是以熊果酸、齐墩果酸和马钱苷等为含量检测指标。山茱萸中熊果酸含量测定的文献报道虽比较多，但熊果酸存在于许多药材如山楂、马鞭草、车前草、紫珠、女贞子、怀牛膝等，非山茱萸的特有成分，并且熊果酸与齐墩果酸这两种成分在天然植物中又是共生共存的。熊果酸与齐墩果酸均属三萜酸，在化学结构上是差向异构体，两者极性几乎无差别。有实验表明，在薄层板上应用《中国药典》条件无法分离开，应用《中国药典》条件测得的熊果酸含量，实际为按熊果酸计算熊果酸与齐墩果酸含量的总和。马钱苷为山茱萸主要有效成分，测定其含量，可为山茱萸及其制剂提供质量控制的有效手段。
实验过程中曾采用甲醇－水、乙腈－水、四氢呋喃-乙腈-甲醇-0.05％磷酸溶液等流动相系统。结果以四氢呋喃-乙腈-甲醇-0.05％磷酸溶液（1∶6∶4∶89）作为流动相能够将马钱苷峰与杂质峰较好的分离。
在提取方法的选择上，以马钱苷含量作为考察指标，对提取溶剂进行考察：取样品1 g 3份，精密称定，分别精密加入甲醇，80%甲醇，50%甲醇25 ml，超声30 min。结果表明：用80％甲醇提取的含量较高，所以选用80%甲醇作为提取溶剂。对提取方式及时间进行考察：取样品1 g 6份，精密称定，精密加入80%甲醇25 ml，3份回流，提取时间分别为20，30，40 min；另3份超声，提取时间分别为20，30，40 min。结果表明，回流和超声两种提取方式对含量结果影响不大，因超声操作较为简便，且20 min能将马钱苷提取完全，故选择超声处理(功率 250 w，频率 49 khz)20 min。
【参考文献】
［1］中华人民共和国卫生部.卫生部药品标准中药成方制剂，第7册［s］.1993：93.
［2］水彩红，曹 红.hplc法测定山茱萸药材及六味地黄胶囊中马钱苷的含量［j］.中国药品标准，2005，6 （4）：17.
［3］张先瑞.hplc法测定耳聋左慈丸中马钱苷的含量［j］.国际医药卫生导报，2007，13(16):113.
［4］赵新峰，孙 毓.胶束电动毛细管色谱法测定山茱萸中莫罗苷和番木鳖苷的含量［j］.药物分析杂志，2007,27(8):1154.
［5］国家药典委员会.中国药典，ⅰ部［s］.北京：化学工业出版社，2005：附录vib.
