作者：李海峰，赵志莲，刘光明

【摘要】  　　目的研究云南红豆杉生长过程中不同部位10-去乙酰巴卡亭ⅲ(10-deacetyl baccatinⅲ)的含量变化。方法采用色谱柱agilent c18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-乙腈-水(42∶13∶45），流速1.0 ml·min-1，柱温32℃，检测波长234 nm，测定云南红豆杉生长过程中不同部位10-去乙酰巴卡亭ⅲ的含量。结果回归方程 y = 15.290 29x -4.059 76 (r = 0.999 0)，线性范围5.50～550 μg·ml-1；加样回收率（n=6）98.6%，rsd为2.4%。在云南红豆杉生长期树皮中10-去乙酰巴卡亭ⅲ含量高于枝叶，是枝叶中最高含量的1.498倍；休眠芽分化期和休眠期是10-去乙酰巴卡亭ⅲ积累的关键时期，在枝叶中的含量显著高于树皮，最高含量达0.115 0%是树皮中最高含量的1.769倍，二年生枝叶中含量略高于一年生枝叶。结论该方法简便、准确度高，可用于云南红豆杉枝叶的质量控制。

【关键词】  云南红豆杉 生长过程 10-去乙酰巴卡亭ⅲ 高效液相色谱法

　　abstract：objectiveto study the content change of 10-deacetyl baccatinⅲ of the different parts in the growing process of taxus yunnanensis.methodshplc was adopted.the mobile phase of agilent c18 chromatogram column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was meoh-acetonitrile-h2o(42:13:45), the flow speed was 1.0 ml·min-1, the column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was set at 234 nm. the content change of 10-deacetyl baccatinⅲ of the different parts in the growing process of taxus yunnanensis was determined. resultsthe regression equation of tenuifolin was y = 15.290 29x -4.059 76 (r = 0.999 0) and the linear range was 5.50～550 μg·ml-1 . the recoveries of 10-deacetyl baccatinⅲ was 98.6% ( rsd = 2.4%).in the growing season of taxus yunnanensis, the content of 10-deacetyl baccatinⅲ in bark was higher than that in branches and leaves, it's 1.498 times of the highest content in branches and leaves.the differentiation period of dormant bud and the period of dormancy were the critical period of 10-deacetyl baccatinⅲ accumulation, the content in branches and leaves was notable higher than that in bark, the highest content was up to 0.115 0%, it's 1.769 times of the highest content in bark. the content in biennial branches and leaves was higher than that in the annual.conclusionthis method is convenient and has high accuracy. it can be used for quality control of taxus yunnanensis branches and leaves.

　　key words： taxus yunnanensis;  growth;  10-deacetyl baccatinⅲ;  hplc
   
　　10-去乙酰巴卡亭ⅲ(10-deacetyl baccatinⅲ,简称为10-dabⅲ)［1］是从红豆杉属植物（taxus）短枝叶中分离、提取得到的一种紫杉烷二萜类化合物，是目前临床和科学研究用紫杉醇和多烯紫杉醇化学半合成的重要前体化合物，在缓解紫杉醇资源短缺问题中起着不可替代的作用。WWw.11665.CoM
   
　　云南红豆杉taxus yunnanensis是我国现有几种红豆杉植物中紫杉醇和10-dabⅲ含量较高、分布最广的树种［2］。从红豆杉枝叶中提取、分离10-dabⅲ，再经过化学半合成生产紫杉醇和多烯紫杉醇，是一条不破坏红豆杉野生植物资源基础上能实现资源再生利用的有效途径。有关10-dabⅲ的研究报道主要是从红豆杉植物中提取、分离、含量测定、半合成紫杉醇和多烯紫杉醇，而对云南红豆杉生长过程中不同部位10-dabⅲ含量变化研究未见报道。因此，本文利用高效液相法对云南红豆杉生长过程中不同部位10-dabⅲ的含量变化作了检测，为建立科学、合理的云南红豆杉枝叶采摘标准提供参考。

　　1  仪器与试剂

　　美国惠普公司agilent1100高效液相色谱仪，包括溶剂箱、四元梯度泵、真空脱气机、微量自动进样器、恒温柱温箱、可变波长检测器。赛样台式计算机（agilent chemstation 色谱工作站）。buchi旋转蒸发仪，sy8200t超声波清洗器（上海声源超声波仪器设备有限公司），ab104电子天平（瑞士mettletoledo公司），dzf-6021型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）。
   
　　10-dabⅲ标准品由sicma提供（纯度＞99%）；样品处理用甲醇、醋酸乙酯为分析纯；高效液相专用去离子水，进行高效液相分析的流动相乙腈、甲醇均为色谱纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  对照品储备液的制备精密称取10-dabⅲ 1 100 μg加入到10 ml容量瓶中，用ch3oh溶解并定容，得对照品储备液(110 μg·ml-1)。

　　2.2  供试品溶液的制备按文献［3］报道的方法，精密称取样品粉末（60目筛）0.5 g，置于100 ml容量瓶中，加甲醇20 ml，超声处理30 min，浸泡24 h，过滤，滤渣分别用15 ml ch3oh按此步骤重复处理2次，合并3次提取滤液，30℃水浴浓缩，加醋酸乙酯-5 %nahco3（1∶1）40 ml萃取，收集醋酸乙酯层，水层分别用10 ml醋酸乙酯萃取两次，合并三次萃取的醋酸乙酯层，30℃水浴浓缩挥干溶剂，用5 ml甲醇定容，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

　　2.3  色谱条件按文献［3］报道的方法，色谱柱为agilent c18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-乙腈-水（42∶13∶45），检测波长234 nm，流速1.0 ml·min-1，柱温32℃，进样量10 μl。

　　2.4 方法专属性在“2.3”项色谱条件下，分别取对照品溶液和供试品溶液进样测定，得到特征峰，供试品溶液与杂质分离良好，无干扰（对照品与样品的色谱见图1～2)。

　　2.5  线性关系考察分别精密吸取适量的对照品储备液，用甲醇依次稀释成55.0 ，44.0 ，33.0 ，22.0 ，11.0 ，5.50 μg·ml-1系列溶液。在“2.3”项色谱条件下，分别进样10 μl，测定标准品峰面积y，以进样浓度x（μg·ml-1）对峰面积进行回归，得回归方程：y = 15.290 29x -4.059 76，r= 0.999 0。结果表明10-dabⅲ浓度在5.50～550 μg·ml-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

　　2.6  精密度实验取33.0 μg·l-1对照品溶液，在“2.3”项色谱条件下，每次进样10 μl，重复进样6次，测定10-dabⅲ保留时间和色谱峰面积值，rsd（n=6）分别为0.36%和0.23%。

　　2.7  重复性实验精密称取同一批样品（9月份采二年生枝叶）0.5 g，共6份，按“2.2”项方法平行制备6份供试品溶液，进样10 μl测定10-dabⅲ含量，结果其平均含量（n=6）为0.023 24%，rsd为2.2%。

　　2.8  稳定性实验分别取一年生枝叶、二年生枝叶和树皮供试品溶液各1份，室温放置，在“2.3”项色谱条件下于0，2，4，8，16，24 h依次进样测定，计算得一年生枝叶rsd（n=6）为2.4%、二年生枝叶rsd（n=6）为2.1%、树皮rsd（n=6）为1.6%，结果表明供试样品溶液在24 h内稳定。

　　2.9  加样回收率实验精密称取已知含量(22.24 μg·l-1)的样品粉末250 mg，共 6份，分别精密加入22.0 μg·l-1的10-dabⅲ对照品溶液1.0 ml。按“2.2”项方法制备成6份供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下，每次进样10 μl测定10-dabⅲ含量，计算回收率，结果平均回收率（n=6）为98.6%，rsd为2.4%。

　　2.10  样品测定云南红豆杉生长过程中不同部位样品采自云南省大理苍山西坡，8次样品采自同一株30～40年树龄的红豆杉树木，采集部位分别是一年生枝叶（当年立春后休眠芽发育而成）、二年生枝叶（由前年立春后休眠芽发育而成）和树皮（成年树主干树皮，少量），采集时间分别为2007-05～12每个月的21日中午，共得24份样品，样品自然风干，含量测定前50℃真空干燥至恒重。按“2.2”项方法，每份样品制备3份供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下测定10-dabⅲ含量，云南红豆杉生长过程中不同部位样品中10-dabⅲ含量变化见图3。

　　3   讨论
   
　　云南红豆杉生长过程主要分为3个时期：生长期(4月～10月)，休眠芽分化期（11月～12月上旬），休眠期（12月下旬～次年3月）。如图3所示，云南红豆杉生长期10-dabⅲ含量在一、二年生枝叶中的变化不大，含量在0.018 53%～0.028 53%之间；树皮中10-dabⅲ含量略高于一、二年生枝叶，含量在0.022 72%～0.042 72%。云南红豆杉休眠芽分化期10-dabⅲ含量在一、二年生枝叶中的显著增加，一年生枝叶含量达到0.102 2%，二年生枝叶中含量达到0.115 1%；一、二年生枝叶中10-dabⅲ含量高于树皮，树皮中的含量仅为0.064 98%。云南红豆杉休眠期10-dabⅲ含量在树皮、一年生枝叶和二年生枝叶中的含量又逐渐降低，但是显著高于生长期，含量变化趋势与休眠芽分化期相似，二年生枝叶中高于一年生枝叶，一年生枝叶中的含量又高于树皮，一年生枝叶中含量为0.083 20%，二年生枝叶中含量为0.093 62%，树皮中含量为0.064 60%。
   
　　从上分析可知，云南红豆杉生长过程中枝叶中10-dabⅲ含量变化很大，而在树皮中的含量相对比较稳定。牟德海等［4］的研究也发现云南红豆杉树皮及枝叶中10-dabⅲ的含量变化很大，10-dabⅲ的含量因植物部位、生长环境和采收季节的不同而有显著差异。本文只对同一株云南红豆杉生长过程中10-dabⅲ含量变化进行研究，对于不同产地、不同植株生长过程中10-dabⅲ含量变化情况还需作进一步深入探讨，才能真正掌握云南红豆杉生长过程中10-dabⅲ含量变化规律，为建立科学、合理的云南红豆杉枝叶采摘标准提供理论依据。

【参考文献】
  　　［1］徐任生.天然产物化学［m］.北京:科学出版社,2004：313.

　　［2］安春志，罗佳波，刘 莉. hplc法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭ⅲ的含量［j］.广州医药,2006, 37 (5):47.

　　［3］李海峰，赵志莲，刘光明.高效液相法测定云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭ⅲ的含量［j］.大理学院学报， 2008，7（2）:33.

　　［4］牟德海，周治发，林展红.反相hplc法分析红豆杉树皮和树叶中紫杉醇及其类似物含量的研究［j］.分析测试学报，1997，16(5)：8.