作者：田登科， 陈刚领， 李亚娟， 胡送友， 刘俊，卞卡
【摘要】 目的观察云南白药(ynby)对自发性高血压大鼠(shr)肾脏炎症状态的影响，探讨其对高血压肾脏疾病的防治作用及机制。方法将6周龄shr分为ynby治疗组和高血压模型对照组，在3个时间点(给药6周，给药14周，停药后9周)研究ynby对shr血压值、肾脏炎性因子表达和氧化应激水平的影响。结果ynby对shr无明显降压作用(p>0.05)。ynby在mrna和蛋白水平抑制了细胞间粘附分子-1(icam-1)和内皮型一氧化氮合酶(enos)在shr肾脏的高表达(p<0.05)。 ynby在给药14周和停药9周时降低了过氧化物酶体增殖物活化受体γ(pparγ)的mrna表达(p<0.05)，在给药14周时明显降低了pparγ的蛋白表达(p<0.05)。ynby给药后显著降低了shr肾脏组织蛋白羰基化水平(p<0.05)，在给药14周及停药9周后均可显著提高shr肾脏总抗氧化能力(p<0.05)。结论ynby给药后能够显著减轻shr肾脏炎症反应和氧化应激水平，ynby可能在防治高血压肾病方面具有一定的疗效。
【关键词】 云南白药; 自发性高血压大鼠; 高血压肾脏疾病; 炎症反应
abstract：objectiveto investigate the effects of yunnanbaiyao(ynby)on inflammatory status of the kidney from spontaneously hypertensive rats (shr), and to explore preventive and therapeutic usage of ynby on hypertensive nephropathy. methods6 weeks old shr were divided into shr control group and shr-ynby group.the effects of ynby on systolic blood pressure, expression of inflammation-related factors and level of oxidative stress were determined at 3 time points: 6 weeks of ynby treatment; 14 weeks of ynby treatment; and 9 weeks post-ynby treatment.resultsynby did not affect the elevation of blood pressure of shr(p>0.05). however, the tcm compound inhibited the expression of intercellular adhesion molecule-1 (icam-1) and endothelial nitric oxide synthase (enos) at both mrna and protein levels (p<0.05). at the time points of 14 weeks of treatment and 9 weeks post-treatment, hmp significantly attenuated peroxisome proliferator-activated receptor γ(pparγ) mrna expression (p<0.05). the protein level of pparγ was also inhibited by ynby markedly after 14 weeks of treatment (p<0.05). ynby significantly reduced protein carbonyl contents of shr kidney (p<0.05). in addition, after 14 weeks of treatment, ynby increased total anti-oxidant capacity of renal tissue from shr (p<0.05) and this elevated anti-oxidant capacity was even maintained for 9 weeks after treatment (p<0.05). conclusionynby can reduce the inflammatory status and oxidative stress of shr kidney, which may serve as the base for the advanced therapeutic utility of ynby in hypertensive renal disease.
key words：yunnanbaiyao (ynby); spontaneously hypertensive rat (shr); hypertensive nephropathy; inflammation
肾脏是高血压的重要靶器官之一。WWw.11665.CoM最近研究表明，炎症反应不仅参与了高血压疾病的发生发展，更是与高血压心、脑、肾等多个靶器官损害密切相关[1]。炎症反应不仅可导致肾脏纤维化和肾单位的损伤，同时也参与了肾小球滤过膜的破坏，因此抗炎相关治疗已经成为防治高血压肾脏疾病新的重要环节。云南白药(ynby)由云南民间医生曲焕章于1902年研制成功，具有活血消肿、止血止痛的功效，临床上可有效应用于多种出血性疾病的治疗[2]。近年来随着中医药学现代化研究的深入，ynby的临床应用也在不断地得到拓展。本研究将观察ynby对shr肾脏炎症状态的影响，进一步明确其作用环节和机理，为开拓其在防治高血压肾脏疾病方面的临床应用提供科学依据。
1 材料与仪器
1.1 实验动物与药物spf级shr 48只，wky大鼠24只，均为雄性，6周龄，购自中科院上海实验动物中心，动物合格证号：scxk(沪)2007-0005。ynby购自云南白药集团公司(批号20051005)。
1.2 试剂与仪器trizol 试剂购自美国sigma-aldich 公司;rt-pcr 试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司;引物合成自上海生工生物工程技术有限公司;抗体购自美国santa cruz biotechnology inc公司。pcr扩增仪：德国biometra 公司;gis凝胶图像分析系统：上海天能科技有限公司;无创尾动脉血压测定分析系统：上海奥尔科特生物科技有限公司;酶标仪spectra max 190：美国molecular devices公司;分光光度计uv-1700：日本shimadzu公司。其它试剂为国产分析纯。
2 方法
2.1 动物分组及给药将48只shr随机分为ynby组和高血压模型组，每组24只，以24只同周龄的wky大鼠为正常对照。将ynby溶于蒸馏水中灌胃给药，药物浓度为20 mg/ml，日用药量为200 mg/kg,shr模型组和wky对照组大鼠每日按10 ml/kg灌胃蒸馏水。分别在给药6周、给药14周和停药9周后分3批处理动物。
2.2 检测指标
2.2.1 血压测定采用无创测量大鼠血压的装置进行尾动脉收缩压测定。测定前将大鼠置于35℃恒温箱中预热10 min，然后测量大鼠在安静、清醒状态下的尾动脉压4～6次，取其平均值。每周定时进行测定一次。
2.2.2 动物处理及肾脏组织总rna、蛋白提取大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，颈椎脱臼处死，取出肾脏组织液氮速冻后-80℃保存，用于总rna、蛋白样品制备。取大鼠冻存肾脏组织50～100 mg，加1 ml trizol试剂，按照试剂使用说明提取总rna，所用rna的a260/a280均在1.8～2.0之间。取大鼠肾脏组织约200 mg，在2 ml中含有蛋白酶抑制剂的 pbs(ph 7.4)中匀浆组织，4℃离心15 min两次，取上清即为总蛋白样本。
2.2.3 逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)按照rt试剂盒说明书进行cdna的合成，pcr扩增所需引物序列及反应条件如表1所示，β-actin作为内参照。扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳，以上海天能图像分析系统对所得条带光密度进行扫描分析。表1 pcr反应所需引物序列及条件
2.2.4 蛋白质印迹(western-blot)分析用lowry法测定蛋白浓度后，按照每孔50 μg蛋白样品上样。聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离总蛋白，电转移蛋白至硝酸纤维素膜，5%的脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入一抗icam-1(1∶200)、inos(1∶400)、β-actin(1∶1000)4℃过夜。pbs-t洗膜3×5 min后，以辣根过氧化物酶(hrp)标记的相应二抗(1∶5000)室温孵育1h，化学发光法进行显色反应，最后在暗室中显影定影。
2.2.5 肾脏组织总抗氧化能力测定采用高铁还原抗氧化能力(frap)测定法。5 μl肾脏组织蛋白样品和245 μl frap工作液在37℃反应10 min后，分别以pbs 和水溶性维生素-e(trolox)作为空白和标准对照，于593 nm处测定吸光度值。
2.2.6 肾脏组织蛋白羰基化水平测定采用2,4-二硝基苯肼(dnph)法测定肾脏组织蛋白羰基化水平。蛋白质被氧化后形成的羰基可与dnph反应生成红棕色的沉淀2,4-二硝基苯腙，将沉淀用盐酸胍溶解后于370 nm处读取吸光度值,从而测定蛋白质的羰基含量。羰基浓度以摩尔消光系数22.0 mmol/(l·cm)计算，羰基含量用每毫克蛋白中含有多少nmol的羰基来表示。
2.3 统计分析所有数据以±s表示，数据分析采用spss11.5统计软件进行单因素方差分析。
3 结果
3.1 ynby对shr血压值的影响结果见表2。模型组shr收缩压较正常对照wky大鼠明显升高(p<0.05)。给药ynby 6周，14周及停药9周后，shr的收缩压与模型组大鼠比较无明显差异(p>0.05)。表2 ynby对shr血压值的影响与wky组比较，▲p<0.05;与shr模型组比较，■p>0.05;n=8
3.2 ynby对shr肾脏icam-1和enos表达的影响见图1(a)、1(b)、1(c)，模型组大鼠肾脏enos和icam-1的mrna表达显著高于正常组(p<0.05)，ynby治疗后(给药6周，给药14周，停药9周)可显著降低shr肾脏enos和icam-1的mrna表达水平(p<0.05)。如图2(a)、2(b)、2(c)所示，与wky大鼠比较，模型组shr肾脏可见enos和icam-1蛋白的高表达(p<0.05)。在各处理批次(给药6周，给药14周，停药9周)ynby均能够显著降低enos 和icam-1的表达水平(p<0.05)。
3.3 ynby对shr肾脏pparγ表达的影响如图1(a)、1(d)所示，模型组大鼠肾脏pparγ mrna表达显著高于正常组(p<0.05)。ynby给药6周后对pparγ的表达无明显影响(p>0.05)，在给药14周和停药9周后可明显降低其mrna水平(p<0.05)。如图2(a)、2(d)所示，与wky大鼠比较，在各处理周龄模型组大鼠pparγ的蛋白表达均有明显提高 (p<0.05)。ynby在给药6周及停药9周后对pparγ的蛋白表达无明显影响(p>0.05)，而在给药14周时能够显著抑制pparγ的高表达(p<0.05)。
3.4 ynby对shr肾脏总抗氧化能力的影响见表3。模型组shr在20，29周龄时肾脏总抗氧化能力相对于wky大鼠明显降低(p<0.05)。ynby给药6周后，shr总抗氧化能力与模型组大鼠比较有提高趋势(p>0.05)，在给药14周和停药9周时shr肾脏总抗氧化能力明显提高(p<0.05)。表3 ynby对shr肾脏总抗氧化能力的影响
3.5 ynby对shr肾脏蛋白羰基化水平的影响见表4。与wky组比较，shr模型组肾脏蛋白羰基化水平显著提高(p<0.05)。ynby给药后，shr蛋白羰基化水平与shr模型组大鼠比较明显降低(p<0.05)。表4 ynby对shr肾脏蛋白羰基化水平的影响与wky组比较，▲p<0.05;与shr模型组比较，●p<0.05;n=8
4 讨论
肾脏是高血压的重要靶器官之一,高血压肾病可导致很高的高血压病致死、致残率。目前关于高血压肾脏损伤的发病机理有许多学说和解释，国际最新研究表明发生于肾脏的慢性炎症反应是高血压肾脏损伤的重要病变因素。成年shr肾脏纤维化、蛋白尿和肌酐清除率降低明显，同时伴随着肾脏炎症因子的高表达和氧化应激的发生[3，4]。
ynby自从20世纪初行销于世以来，誉满中外，历久不衰，被誉为伤科圣药。我们研究中心首次对ynby的心血管系统现代药理学作用进行了创新性审视，认为ynby可能在抑制炎症反应、保护血管内皮、降低氧化应激方面具有一定作用，而有关ynby在此方面的应用却未见报道。本研究将通过观察ynby对shr肾脏炎症状态的影响，探索其对高血压时肾脏损害的保护作用及机理。
动脉压增高是高血压时肾脏发生病变的重要诱因。然而研究表明，在血压未升高的幼龄shr肾间质中便存在着单核/巨噬细胞的浸润和nadph氧化酶的活化，这表明炎症反应和氧化应激可能不依赖于血压值的增高而引发肾脏损伤[5]。在保护高血压靶器官损伤、降低高血压各种临床终点事件中，降压也并非是唯一重要的疗法，这可以从hmp及他汀类药物能够独立于血压值之外减轻高血压并发症中得到证明[6，7]。
肾脏炎症反应发生时，肾小管上皮细胞icam-1 和血管细胞粘附分子-1(vcam-1)表达增加，二者可能介导了白细胞从小管周围毛细血管内皮细胞到肾脏间质的迁移[8]。成年shr肾小球细胞和血管内皮细胞icam-1蛋白表达明显提高，大量单核细胞浸润肾小球，24h尿蛋白量增多，并且核转录因子-κb (nf-κb)的活化与icam-1的表达及单核细胞浸润、尿蛋白量均呈明显正相关[9]，提示原发性高血压时活化的nf-κb可通过上调肾组织icam-1 基因表达，促进单核细胞浸润肾组织从而引发肾脏损害。生理条件下由enos产生的no在调节血管张力、抑制血小板聚集和白细胞黏附、抑制血管平滑肌细胞(vsmc)增殖方面起了重要作用。然而在多种病理状况下往往伴随着enos脱偶联的现象，此时enos不再产生no而是产生大量的氧自由基，而且过氧化氢能够刺激enos在血管壁的代偿性增高[10，11]。实验结果表明shr肾脏enos较wky明显提高，提示shr肾脏enos脱偶联病理现象的存在。ynby能够显著降低shr肾脏enos的表达水平，表明ynby可通过干预enos脱偶联的现象而起到肾脏的保护作用。同时在本研究中，ynby在mrna和蛋白水平降低了shr肾脏icam-1的表达，提示ynby对发生于shr肾脏的慢性低度炎症反应具有显著的抑制作用。
pparγ具有抗炎和抗氧化作用。在fischer 344大鼠肾脏中pparγ通过抑制p65核易位和nf-κb的结合活性，从而降低了诱导型一氧化氮合酶(inos)、 环氧合酶-2(cox-2)、 il-1β、 il-6和vcam-1的表达[12]。在原代培养的血管内皮细胞中pparγ可同时上调铜锌超氧化物歧化酶(cuzn-sod)的表达和下调还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)氧化酶亚单位phox22的表达[13]。然而，在肾脏纤维化实验动物模型中pparγ却呈高表达，而且罗格列酮降低了pparγ的表达水平[14，15]。与此相似本研究发现pparγ在shr肾脏组织中高表达，这可能是机体对炎症及氧化损害所发生的一种代偿性反应，推测ynby对炎症反应和氧化应激的抑制可能是下调pparγ表达的作用机理。同时在本研究中ynby治疗后对pparγ的mrna和蛋白表达虽有降低作用，但没有出现同步变化。考虑到pparγ的转录活性不仅与其mrna及蛋白表达水平有关，还与pparγ翻译后修饰如泛素化和n-末端磷酸化、抑制剂调节等多种因素密切关联[16]，ynby对pparγ活性的具体影响及机制尚有待进一步研究。
炎症发生时多伴随氧化应激水平的增高。活性氧(ros)可通过直接氧化修饰蛋白质、脂质、糖类和dna造成组织损伤;ros还可上调nf-κb的活性和转化生长因子-β(tgf-β)的表达，进而引发局部的炎症反应和纤维化过程[17，18];ros可通过负向调节l-arg的转运[19]，氧化失活bh4[20]，氧化enos的锌指结构造成enos脱偶联[10]，因此ros被认为是导致enos脱偶联和内皮功能损伤的核心机制。含氮自由基过氧化硝酸盐(onoo-)还可与cuzn-sod分子结构域中的cu发生反应，在sod分子上将酪氨酸残基硝基化，sod自身硝基化后其清除ros的能力会显著降低[21]。研究表明在转基因ren-2大鼠肾脏中，nadph氧化酶的活化和ros的过量产生造成了足细胞足突消失和微动脉纤维化等肾脏损害[22]。总抗氧化能力可以反映机体的氧自由基代谢状况——总抗氧化能力降低表明机体氧自由基清除不足，生成相对过量，而蛋白羰基化含量可用来衡量蛋白质氧化损伤的程度。ynby组分中的麝香、重楼、三七均具有显著的抗氧化作用。本研究发现ynby给药后明显提高了shr肾脏组织的总抗氧化能力，同时降低了蛋白质氧化损伤程度，提示ynby可通过抗氧化应激作用保护高血压肾脏损伤。
总之，本研究证明ynby对shr血压值无明显影响，然而能够通过抑制shr肾脏炎性因子的表达，减轻氧化应激改善高血压时发生于肾脏的炎症反应，提示hmp在高血压肾脏疾病的防治方面具有一定的应用潜能。关于ynby对shr肾脏纤维化、硬化及肾小球滤过膜包括血管内皮细胞、基膜和足细胞裂孔形态学的影响尚需进一步研究和观察。
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