作者：曾建春， 樊粤光 刘建仁，曾意荣，李显彭，易春智
【摘要】 目的研究补肾中药杜仲含药血清对骨髓间充质干细胞(bmscs)增殖及定向分化的影响。方法将第4代mscs以5×106接种于9块96孔板，3组，每组8孔;2块6孔板，每板3孔，2 d后换液，加入诱导液。分为空白组、地塞米松组、杜仲组。空白组加入含10%胎牛血清(fbs)的 l-dmem培养基继续培养，地塞米松组在基础培养基加入诱导剂(含β甘油磷酸钠10mmol/l，地塞米松0.1 μmol/l，维生素c 50 mg/l)，杜仲组为含10%杜仲含药血清的l-dmem培养基。分别自加诱导液第1天起，采用mtt法测量96孔板细胞数，每天1块板;在第10天取出1块6孔板做alp染色;第20天做6孔板茜素红染色。结果杜仲含药血清组od值呈现出明显的上升趋势，而空白组和地塞米松组无明显上升趋势;第10天杜仲组及地塞米松组alp染色阳性，第13天起可见白色钙结节，第20天茜素红染色阳性。结论杜仲含药血清能促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并刺激细胞增殖。
【关键词】 杜仲; 骨髓间充质干细胞 ; 成骨细胞
abstract：objectiveto study the generation and directional differentiation of bmscs induced by duzhong(eucommia bark ) which can invigorate the kidney. methodsinoculated quartus generation mscs in nine ninety six-hole cell culture plates and two six-holes cell culture plates by 5×106 cells per milliliter, all the holes were divided into three groups named blank group, dxm group and duzhong(eucommia bark ) group , each group had eight holes or three holes, two days later, changed medium and added new medium. the medium of dxm group contained 10mmol/l β-sodium glycerophosphate, 0.1 μmol/l dxm, 50mg/l vitamin c, that of duzhong(eucommia bark ) group contained 10% blood serum containing duzhong(eucommia bark ). measured cell number of 96-hole plates from the second day to the eighth day, one of the 6-holes plates was colored by akp staining solution at the tenth day, the last one was colored by alizarin bordeaux on the twentyth day.resultsthe od value of duzhong(eucommia bark ) group rose obviously, blank group and dxm group had no obvious ascensus; on the tenth day dxm group and duzhong(eucommia bark ) group were colored masculine; white calcium nodus could be seen on the undersurface of the holes 13days later, which could be colored by alizarin bordeaux twenty days later. conclusionblood serum containing duzhong(eucommia bark ) can induce bmscs differentiate to osteoblast and stimulate growth of cells.
key words：duzhong(eucommia bark ) ; mscs; osteoblast
间充质干细胞 (mscs ) 是一种多潜能成体干细胞，主要存在于骨髓，还存在于胚胎时期间充质来源的骨外组织，如皮肤成纤维细胞、脂肪干细胞、骨骼肌的卫星细胞和血管内皮细胞等。WWw.11665.COm骨髓mscs ( bmscs )是骨髓基质的组成成分，体外分离培养后，在一定的诱导条件下，具有向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多向分化的能力。在骨组织工程的种子细胞来源主要有成骨细胞和bmscs等。成骨细胞虽然具有良好成骨活性，但来源有限，大量分离获取困难，体外大量扩增的潜力不足，难以满足骨组织工程临床应用的需要;bmscs不仅具有良好的成骨细胞分化潜能和高成骨活性，而且具有强大的增殖潜能，来源方便，可以满足自体组织工程。中医认为，肾主骨，生髓。本实验拟研究补肾中药杜仲含药血清对bmscs增殖及定向分化的影响。
1 材料与仪器
1.1 动物 spf sd大鼠50只，体重150～200g，雌雄不限，由广州中医药大学实验中心提供。
1.2 试剂 l-dmem培养基、南美洲胎牛血清(fbs、海克隆)，β甘油磷酸钠、地塞米松、维生素c、茜素红、mtt(广州威佳)，dmso(sigma)，杜仲(产地云南)，碱性磷酸酶染液、碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物有限公司)，0.25%胰酶(gibco公司)。
1.3 器材75cm2培养瓶、96孔板、6孔板(coning)，酶标仪(thermo)，co2培养箱 (heraeus)，注射器针头滤器，0.22μm滤膜(millipore)，sigma-3k15离心机(sigma)。
2 方法
2.1 杜仲含药血清的制备取杜仲药材粗粉150g，加70%乙醇10倍量，加热回流两次，1 h/次，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至300ml，室温冷却，4℃冰箱保存备用。将中药药液稀释至0.3g生药/ml灌胃，1 ml/次，2次/d，连续给药4 d，最后一次给药后1 h经腹主动脉采血，室温静置3 h后置4℃冰箱过夜，2 500 r/min离心20 min，收集上清液，针头滤器过滤除菌，置-20℃保存备用。
2.2 培养基配制空白组为含10%fbs的 l-dmem培养基;地塞米松组在空白组基础上加入诱导剂，其终浓度分别为β甘油磷酸钠10 mmol/l，地塞米松0.1umol/l，维生素c 50 mg/l;杜仲组在l-dmem培养基中加入10%杜仲含药血清。
2.3 mscs分离培养sd大鼠经腹腔10%水合氯醛0.7ml麻醉后，75%酒精浸泡颈部以下躯体5 min，无菌条件下取出双下肢股骨和胫骨，修洁软组织后，咬骨钳修剪骨端，暴露髓腔，10 ml注射器吸取含10%胎牛血清的l-dmem培养基反复冲洗髓腔，直到骨质外观微微透亮。75cm2培养瓶收集骨髓冲洗液，放37℃、5%co2孵箱培养。每3天换液1次。
2.4 mscs传代当细胞长满瓶底90%后，0.25%胰酶消化后，以1∶3比例传代。
2.5 mscs诱导分化取p4细胞，当细胞长满90%后，0.25%胰酶消化制备细胞悬液后，以每孔150μl ，细胞密度5×106左右接种于9块96孔板中，3组，每组8个复孔;2块6孔板，每板3孔，每孔2ml。当细胞长满瓶底80%以上后换液，加入成骨诱导液。
2.6 mtt测量细胞数从加入诱导液24 h后开始测量，每天测一块96孔板。向96孔板每孔内加入5 mg/l的mtt 15 μl，置37℃孵箱培养4 h后，吸出培养液，显微镜下可见孔底有黑色甲簪沉积，加入二甲亚枫(dmso)150μl，摇床振荡10 min后，酶标仪上测量490nm处od值。取各组平均值绘制细胞增殖曲线。
2.7 碱性磷酸酶染色诱导培养第10天取出1块6孔板，吸去培养基， pbs清洗2遍，加入固定液固定10 min后;加入底物，37℃水浴15min，水洗;再加入苏木素复染10 min，水洗，晾干，镜下观察。
2.8 茜素红染色诱导培养第20天取出1块6孔板，吸去成骨细胞诱导液, pbs 洗3 次，95%酒精固定 10min, 加入 0. 1%茜素红- tris- hcl (ph 8. 3) 37℃,30 m in, 镜下观察结果。
3 结果
3.1 细胞形态学观察mscs为成纤维样细胞，贴壁后成梭形(见图1a)。加入诱导液后，空白组细胞无明显变化;地塞米松组第5天开始出现细胞成聚集生长，细胞体积增大(见图1b);杜仲含药血清组从第3天开始出现细胞成聚集生长，细胞体积增大(见图1c)。12 d后地塞米松组和杜仲组见明显结节形成(见图1d)。
图1 细胞形态学观察
3.2 细胞增殖曲线见图2。
图2 细胞增殖曲线
可见当细胞贴壁长满瓶底后，由于接触抑制，空白组处于一条平缓的曲线，地塞米松组细胞增殖不如杜仲组明显。
3.3 碱性磷酸酶染色第10天，经细胞碱性磷酸酶染色，可见细胞内蓝色颗粒，细胞聚集区成紫黑色。(见图3)。
图3 碱性磷酸酶染色(10×10) 图4 茜素红染色(10×10)
3.4 茜素红染色第20天，茜素红染色可见红色结节堆积(见图4)。
4 讨论
4.1 杜仲含药血清的制备血清药理学在某种程度上可以克服中药制剂本身的理化性质等不确定因素对实验结果的干扰， 而且相对接近药物在体内生物转化的真实过程。即其具有两大优点：①体现复方体内生化转化效应;②克服药物本身理化性质对实验的直接干扰[1]。选用同源性的动物制备血清，可以减少因种属差异而造成的免疫反应，提高实验结果的可靠性[2]。有人认为含药血清中原有许多酶、抗体、补体、细胞因子及其它生物活性物质, 它们对体外培养的细胞、病毒、病原菌以及用于体外实验的组织器官可能产生直接影响而干扰实验结果, 影响药物疗效的客观评价。血清灭活后可排除这些干扰因素对实验结果的影响, 有助于减少血清的非药理性干扰[3]。但中药成分复杂，在体内的药理作用复杂，非灭活血清更能体现药物在体内的作用，且实验过程中未见细胞毒性作用。
4.2 原代mscs分离培养常用于mscs分离的方法主要采用密度离心法和全骨髓法，而流式细胞仪分离法与免疫磁珠法操作繁琐、费用昂贵，并且对细胞活性影响较大，使用受到限制。本实验采用全骨髓贴壁分离法，得到形态均匀一致的mscs。离心法是根据间充质细胞与其他细胞密度不同，用分离液分离的方法。全骨髓法是根据间充质细胞能在培养瓶中贴壁生长的特点进行分离，实验发现与密度离心法所获细胞纯度无统计学差别[4]。全骨髓法操作简单、设备要求低、费用低廉，血液成分的存在以及其所含的生长因子与促贴附物质提供了一个稳定的培养环境和营养物质，有利于mscs的贴附与增殖[5];研究表明扩增一代、两代后细胞纯度可以达到95%和98%[6]。也有人将不同的分离方法合用[7]发挥更好的作用。
4.3 杜仲含药血清诱导mscs的临床意义骨组织工程学具有广阔的临床应用的前景，成为现代骨科学的研究热点。bmscs作为目前最为理想的骨组织工程种子细胞，对其作用研究的中心任务则是如何使之在尽可能简单的条件下定向分化为成骨细胞，进而转化为成熟的骨细胞。
目前对mscs定向分化常用的诱导剂由地塞米松、维生素c、β-甘油磷酸钠组成。而在体外培养中，地塞米松对细胞增殖具有抑制作用[8]，与本实验所见相同;临床上地塞米松具有引起感染、骨坏死、骨质疏松等副作用，将会限制mscs移植后在体内的作为诱导剂的运用。杜仲具有补肾、强筋骨的作用，实验证明具有促进mscs增殖和诱导mscs向成骨分化的作用。长期的临床运用中，未见杜仲的毒副作用，将其作为体内诱导剂具有广泛的临床运用前景。
总之，目前对于mscs作为骨组织工程种子细胞的研究，大多还处于实验阶段，如何能在较短时间内得到足够的mscs，并运用简单的方法诱导其向成骨分化，是目前研究的重点。尽管具有补肾、强筋骨作用的杜仲促进mscs分化和增殖作用的机制尚有待进一步研究，但将其作为mscs分化诱导剂，用于mscs移植治疗骨折延迟愈合、不愈合、骨坏死等具有光明的前景。
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