作者：王光忠 李桥 宋恬 张明 樊文娟 刘焱文
【摘要】 目的采用高效液相色谱（hplc）法测定复方脑得生总黄酮的指纹图谱。 方法采用d-101树脂分离纯化脑得生黄酮类成分。色谱柱为hypersil ods- c18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-乙腈-0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱；检测波长210 nm；流速1.0 ml·min-1; 柱温25℃；分析时间100 min。结果指纹图谱中标示了23个共有峰，其峰面积之和大于总峰面积的90%，方法精密度、稳定性、重复性均符合指纹图谱有关规定。利用指纹图谱相似度测试软件，测定11批脑得生总黄酮指纹图谱相似度结果均在0.95～1.00之间。结论实验结果为脑得生制剂的质量控制提供了依据。
【关键词】 复方脑得生 黄酮类成分 指纹图谱 高效液相色谱法
脑得生丸（片）收载于《 中国 药典》2005年版ⅰ部，由三七、川芎、红花、葛根、山楂5味中药组成，具有活血化瘀、通经活络的功效。用于瘀血阻络所致的眩晕、中风，症见肢体不用、言语不利及头晕目眩；脑动脉硬化、缺血性脑中风及脑出血后遗症见上述证候者［1］。wWW.11665.cOm临床应用广泛,疗效确切。但其制备方法为传统生产工艺，质量可控性差，药物稳定性难以控制，因而对临床疗效和患者服用有较大的影响，不能适应 现代 临床用药要求。研究表明，脑得生的主要活性部位为黄酮类成分、三七总皂苷和川芎油［2］，其中葛根、山楂、红花所含黄酮类成分具有多种药理作用［3～5］。为保证制剂质量和临床疗效，前期进行了制剂中药材的活性部位提取纯化的工艺研究。本研究以黄酮为主要分析对象，采用hplc法对脑得生总黄酮提取物进行了指纹图谱研究，为脑得生制剂的质量控制提供 科学 依据。
1 仪器与试药
1100型agilent高效液相色谱仪;bp211d 电子 天平（sartorius公司）。葛根素、羟基红花黄色素a对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号分别为110752－200209、111637－200502）；试剂均为分析纯，甲醇（上海振兴化工一厂），乙腈（国药集团化学试剂有限公司），磷酸（武汉化学试剂厂）；水为双蒸水。脑得生总黄酮提取物（自制，批号070621，070630，070712，070719，070726，070703，070710，070717，070724，070731,070823）
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱hypersil ods- c18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相见表1；检测波长210 nm；流速1.0 ml·min-1; 柱温25℃ 。表1 流动相梯度变化（略）
2.2 对照品溶液的制备称取葛根素、羟基红花黄色素a对照品适量，加40％的乙醇配成浓度分别为0.081，0.147 mg·ml-1的溶液，即得。
2.3 脑得生总黄酮提取物的制备方法称取葛根、山楂和红花饮片共500 g（按处方组成，葛根∶山楂∶红花为261∶157∶91），70％乙醇回流提取3次。第1次用乙醇5 000 ml，回流提取2 h；第2次用乙醇4000 ml，回流提取1 h；第3次用乙醇3 000 ml，回流提取1 h。合并3次提取液，回收乙醇至无醇味，放置过夜，滤过，溶液稀释至每毫升含生药0.1 g，上d-101树脂柱（1.5 kg树脂），上样流速为2 bv·h-1，上样后先用5bv的蒸馏水冲洗，再用5 bv40％乙醇以3 bv·h-1流速洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩至小体积，干燥，即得。共制得11批。
2.4 供试品溶液的制备取脑得生总黄酮提取物约0.4 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加40％的乙醇溶液超声溶解，定容至刻度，摇匀，即得。
2.5 测定方法分别精密吸取供试品溶液10 μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件操作，考察150 min内供试品溶液的色谱分离情况，记录100 min色谱图。结果见图1。
2.6 方法学考察
2.6.1 精密度与稳定性实验取同一供试品溶液（批号：070710），分别于0，2，4，6，8，10 h进样测定。测定结果表明，其共有峰相对保留时间和峰面积比值的rsd均小于3％，表明仪器的精密度良好，供试品溶液在10 h内基本稳定。
2.6.2 重复性实验精密称取7号样品（批号：070710）6份，按上述供试品溶液的制备方法操作，进行测定，结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的rsd分别为0.06％～0.56％，1.20％～2.90％，符合指纹图谱的要求。
2.7 指纹图谱及其技术参数
2.7.1 共有指纹峰的标定根据11个批次提取物的检测结果，比较其色谱图。结果见图2。以相对保留时间标定其共有峰共23个，以8号峰为参照峰，测定各共有峰相对保留时间和相对峰面积的比值，其rsd均小于3％。
2.7.2 非共有峰峰面积的比值 计算 非共有峰占总峰面积的比值。结果表明，其比值小于10％，符合指纹图谱的要求。
2.7.3 主要色谱峰的鉴别在相同色谱条件下，测定葛根素对照品及羟基红花黄色素a对照品，并与样品指纹图谱中相应图谱峰进行比较，发现样品指纹图谱中8号峰的保留时间与葛根素信号峰吻合，9号峰的保留时间与羟基红花黄色素a的信号峰吻合，故样品指纹图谱中8，9号峰鉴定为葛根素和羟基红花黄色素a。
2.7.4 强峰的标定根据指纹图谱技术要求，其强峰的总面积和占整个峰面积的70％以上，且峰数占总峰数的1/5～1/3，比较各批色谱图，其共有峰中的4，8（s），9，10，11，12号峰的总和占总峰面积的80%以上，故标定第4，s，9，10，11，12号峰为该指纹图谱的六强峰。
2.8 指纹图谱相似度评价采用药典委员会推荐得中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件 (2004a)，对所得指纹图谱进行评价。结果见表2。表2 不同批号提取物指纹图谱相似度评价（略）
3 讨论
本研究按照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》［6］采用hplc法对复方脑得生总黄酮提取物的指纹图谱及其技术参数进行了研究，取得了较满意的结果，标定了23个共有峰，方法学考察其精密度、稳定性、重复性均良好，表明所建立的复方脑得生总黄酮提取物hplc指纹图谱方法可行。运用指纹图谱相似度软件对复方脑得生总黄酮提取物hplc指纹图谱进行了相似度计算，为客观评价其质量提供一定依据。
实验中分别选用甲醇－0.2％磷酸水溶液、乙腈－0.2％磷酸水溶液、甲醇-乙腈－0.2％磷酸水溶液等系统进行梯度洗脱，结果选择甲醇-乙腈－0.2％磷酸水溶液进行梯度洗脱时，得到的色谱峰形较好，且较稳定。记录该色谱条件下150 min色谱图，100 min后无色谱峰出现，故色谱记录时间为100 min。
比较了200～400 nm所得的hplc图谱，结果在210 nm波长检测时，其hplc图谱中可见较多的色谱峰，同时各色谱峰分离度较好，故确定210 nm处波长为检测波长。
11个不同批次提取物的指纹图谱具有较好的相似度、相对保留时间和相对峰面积的比值范围，从而为复方脑得生总黄酮提取物工艺稳定性提供重要依据，并为其产业化奠定基础。
【 参考 文献 】
［1］国家药典委员会.
