作者：胡朗吉，葛郁芝，罗骏，杨涛，张淑华，吴志婷

【摘要】   　　目的研究甘松挥发油对大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流(transient outward potassium current，ito)的影响，探讨甘松挥发油抗心律失常作用的离子机制。 方法用急性酶解分离法获得单个大鼠心室肌细胞，采用标准的全细胞膜片钳技术记录大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流(ito)。结果甘松挥发油可呈浓度依赖性和电压依赖性抑制ito。在+70mv时，3 μg/g，6 μg/g，10 μg/g和20μg/g甘松挥发油分别抑制ito峰值电流的抑制率为 (27.01±6.93)%(n=5)， (51.13±9.82)%(n=5)， (80.86±4.63)%(n=5)和(94.81±4.30)%(n=5)。甘松挥发油对ito的电流密度-电压关系曲线(current density-voltage curve，i-v曲线)的影响：在+70 mv时，6μg/g甘松挥发油使ito峰电流从(23.081±0.74)pa/pf减少到(11.232±1.47) pa/pf (n=5， p<0.05)，给药后电流密度减少约50%，给药前后电流密度变化有统计学意义。甘松挥发油对ito激活和失活曲线的影响：在甘松挥发油6 μg/g灌流法给药后，激活曲线显示给药前后半数激活电压(v1/2)为：(36.063 ±1.792)mv vs (34.788±3.029)mv(p> 0.05，n=5)；斜率因子(s) 为：(22.972±1.491)mv vs (30.791±2.899)mv(p<0.05，n=5)。wwW.11665.com给药前后半数激活电压变化无显著差异。失活曲线显示甘松挥发油使失活曲线明显左移，差异有显著统计学意义：给药前后半数失活电压(v1/2)为(-33.738±0.476)mv vs (-40.536±0.696)mv (n=5, p<0.01)；斜率因子(s)为：(5.001±0.396) mv vs (8.420±0.620) mv (n=5, p<0.01) 。结论甘松挥发油可呈浓度和电压依赖性抑制大鼠心室肌细胞ito，使i-v曲线下移，但对激活曲线无明显影响，同时，使失活曲线明显左移，使心室肌细胞复极化减慢，这可能是其抗心律失常作用的重要机制之一。

【关键词】   甘松挥发油 膜片钳技术 瞬时外向钾电流 心室肌细胞

　　abstract：objectiveto observe the effects of the volatile oil of nardostachys chinensis(vonc) on transient outward potassium current in isolated ventricular myocytes in rats. methodssingle ventricular myocyte of rats were obtained by enzymatic dissociation．the whole-cell patch clamp recording technique was used to record the change of  ito current by the effect of the volatile oil of nardostachys chinensis. results1. the volatile oil of nardostachys chinensis could reduce the ito current with dose-dependent block manner. at concentrations of 3, 6, 10 and 20 μg/g, the peak ito current  was respectively reduced (27.01±6.93)% (n=5, p<0.05), (51.13±9.82)% (n=5, p<0.05), (80.86±4.63)% (n=5, p<0.05) and (94.81±4.30)%(n=5, p<0.05). 2. the volatile oil of nardostachys chinensis also could reduce ito corrent in voltage-dependent block manner. the current density of ito was impacted by the concentration at 6μg/g of the volatile oil of nardostachys chinensis. the peak current density of ito was reduced to 11.23±1.47pa/pf from 23.08±0.74pa/pf (n=5, p<0.01) at membrane potential of +70 mv after treatment with the volatile oil of nardostachys chinensis at 6 μg/g. it was reduced about 50％. 3. the activity curve had no significant change after treatment with the volatile oil of nardostachys chinensis (6μg/g). their v1/2 were (36.063 ±1.792)mv vs (34.788±3.029) mv(n=5, p> 0.05) and slope were (22.972±1.491) mv vs (30.791±2.899) mv(n=5, p< 0.05). the inactivation curve was shifted towards the negative direction after treatment with the volatile oil of nardostachys chinensis(6 μg/g).their v1/2 were (-33.738±0.476) mv vs (-40.536±0.696)mv (n=5, p<0.01) and slope were(5.001±0.396)mv vs (8.420±0.620)mv (n=5, p<0.01). conclusionthe volatile oil of nardostachys chinensis exercutes the blocked function to ito in dose dependent and voltage dependent manners, and its dosage alters the i-v curve, but does not alter the active curve.

　　key words： the volatile oil of nardostachys chinensis;  patch-clamp recording technique;  transient outward potassium current;  myocardium
   
　　甘松nardostachys chinensis又名香松，甘香松，为败酱科植物甘松nardostachys chinensis batal或匙叶甘松 nardostachys jatamansi dc的干燥根及根茎［1］。它具有多种药理作用。实验与临床研究证明，甘松是一种安全有效的抗心律失常药物［2，3］。甘松挥发油是甘松有效浓缩成分［4］。有研究报道，甘松挥发油对大鼠单个心室肌细胞有明显的内向电流阻滞作用［5，6］。但是甘松挥发油对单个心室肌细胞其他离子通道的影响目前还未有报道。本实验采用全细胞膜片钳技术，通过动物实验观察甘松挥发油对大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流(transient outward potassium current，ito)的影响，并进一步探讨甘松挥发油抗心律失常作用的离子机制。

　 　1  材料

　　1.1  动物体重250～350 g成年wistar大鼠，雌雄兼用，由南昌大学医学院动物中心提供。

　　1.2  药物及试剂甘松挥发油经称取阴干后的甘松样品1 000 g，按《 中国 药典》（ⅰ部）甲法［7］进行水蒸馏提取，经6 h后停止加热，静置过夜，油水相分离后得浅绿色油状液体，用双向溶剂二甲基亚砜，按1:200的比例进行稀释。i型胶原酶(collagenase i)、hepes(n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙磺酸)，cscl(氯化铯)，谷氨酸，tea-cl(氯化四乙胺)，na2atp，egta为sigma公司产品，其它试剂均为国产分析纯。

　　1.3  实验溶液无钙台氏液为(mmol/l)：nacl 136，kcl 5.4，mgcl2 1.0，nah2po4 0.33，hepes 10，glucose 10，用naoh调ph至7.4。kb液为(mmol/l)：kcl 40，kh2po4 20、mgso4 3.0，koh 80，谷氨酸50，牛磺酸20，hepes 10，glucose 10，egta 0.5,用koh调ph至7.4。ito细胞外液为(mmol)：nacl 140，kcl 4，cacl2 1.5，cdcl2 0.5，mgcl2 1，hepes 5，glucose 10，用naoh调ph值至7.4。ito电极内液为(mmol/l)：kcl 140，mgcl2 1，hepes 10，egta 5，k2atp 5，用naoh调ph值至7.3。

　　1.4  仪器膜片钳放大器(axopatch 200b)及digidata 1200b型数/模（或模/数）转换器均为美国axon公司。   

　 　2  方法

　　2.1  单个大鼠心室肌细胞的制备以5 u/g肝素钠对分离大鼠进行腹腔内注射，10～15 min后以1%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔内注射麻醉，迅速开胸取出心脏，放入4℃无钙液中，离体心脏修饰后经主动脉挂在langendorf灌流仪逆行用无钙台氏液经主动脉逆行灌流5 min，通以100%纯氧。10 min后以浓度分别为0.6～0.7g/l i型胶原酶，0.04～0.06 g/l蛋白酶e，0.3～0.5 g/l牛血清白蛋白（bsa）和50 μmol/l低钙酶液灌流心脏。30 min左右心脏松软后，改180～200   μmol/l低钙台氏液灌流心脏5 min，温度维持在36～37℃，灌流过程中始终予以氧气饱和，氧流量0.3～0.5 l/min。5 min后，将心脏从灌流装置上取下，剪除心房和乳头肌,留下心室肌组织块置于盛有kb液的烧杯中充分剪碎、轻轻吹打、100目尼龙网过滤，以去除可能影响离子流记录的组织碎片。过滤后置于kb液中室温下孵育1～2 h，然后置于4℃冰箱中保存。

　　2.2  膜片钳全细胞记录选取纹理清晰、杆状和大小适中的细胞在室温下进行实验，将适量细胞加入体积约1.5 ml平放于倒置显微镜上的细胞池中，贴壁10 min后，用灌流法加药，流速约1.5 ml/min。在电极拉制仪分两部拉制电极，电阻1～2 mω。电极内灌以电极液，置于推进器上，通过三维操纵器驱动电极，并轻压在细胞表面，用负压使电极与细胞表面形成高阻封接后，补偿快电容并吸破细胞膜形成全细胞记录模式。调节慢电容补偿和串联电阻补偿80％～90％以减少瞬时充放电电流和钳位误差。信号经截止频率为1 khz的四阶贝塞尔低通滤波器，采样率为10 khz。实验在室温(22～24℃)下进行。实验过程由pclamp 9.0软件程序(axon，美国)控制，通过ad/da转换板(axon digidata 1200，美国)，进行刺激发放和信号采集，并存储于 计算 机硬盘中，供测量及分析用。为消除细胞间误差，电流值以电流密度(pa/pf)表示。

　　2.3  统计分析采用pclamp9.0软件对单个全细胞记录进行数据和图形转换，origin7.0软件对数据进行曲线拟合及绘制浓度-剂量曲线，离子通道电流密度-电压曲线，电流密度(pa/pf)=电流强度／电容；激活-失活关系曲线。所有数据以±s表示，用spss13.0统计软件做统计分析，采用配对样本t检验。

　　 3结果

　　3.1  甘松挥发油对ito峰电流的影响在形成全细胞状态后，在电压钳模式下，细胞钳制电位（holding potential,hp）在-40 mv，从指令电位（command potential, cp）-40 mv逐步除极至+70 mv，阶跃+10 mv，钳制时间（clamp time, ct）40 ms，刺激频率0.5hz，记录ito。然后，用灌流法给药，分别以含甘松浓度3，6，10，和20 μg/g的细胞外液灌流细胞5 min。在+70 mv时，不同浓度的甘松挥发油分别阻断ito峰电流(27.01±6.93)%，(51.13±9.82)%，(80.86±4.63)%和(94.81±4.30)% (n=5)。

    将算出的各浓度抑制率为纵坐标作图，并取其对数，得出剂量-抑制率的关系曲线(图1～2)，然后采用i=imaxcn/(cn+ec50n)方程进行拟合，得出半数有效浓度(ec50)和斜率因子(s)。半数有效浓度(ec50)值为：(5.782±1.118)μg/g；斜率因子(s)为:1.785±0.492。

    通过分析甘松挥发油对ito作用的量-效曲线，可以表明甘松挥发油可呈浓度依赖性抑制大鼠心室肌细胞ito峰值电流。
　
　　3.2  甘松挥发油对ito的电流密度-电压关系曲线的影响以膜电位为横坐标，其相应的ito峰值电流为纵坐标，绘制电流-电压曲线(i-v曲线)。电流密度(pa/pf)=电流强度/膜电容。对心室肌细胞用含6 μg/g甘松挥发油细胞外液灌流，发现含6 μg/g甘松挥发油浓度的细胞外液使i-v曲线下移(见图3)。在+70 mv时，甘松挥发油(6 μg/g)使ito峰电流从(23.081±0.74)pa/pf减少到(11.232±1.47) pa/pf (n=5，p<0.05)，给药前后抑制率约为50%，差异有统计学意义。
　
　　3.3  甘松挥发油对ito激活动力学的影响观察ito的激活动力学特征，将i-v曲线的结果转换为膜电导，对条件刺激电压作图，然后采用boltzmanne方程i/imax=1/{1+exp-(v-v1/2)/k}进行拟合，式中得到ito激活曲线(图4)，然后求得半数激活电压(v1/2)和斜率因子(s)。6 μg/g甘松挥发油灌流给药后，激活曲线显示给药前后半数激活电压(v1/2)为：(36.063 ±1.792)mv vs (34.788±3.029)mv(p>0.05，n=5)；斜率因子(s)为：(22.972±1.491)mv vs (30.791±2.899)mv(p< 0.05，n=5)。给药前后半数激活电压变化无显著差异。

　　3.4  甘松挥发油对ito失活动力学的影响稳态失活曲线　采用双脉冲刺激法，hp=-40mv，条件脉冲-100～+20 mv，钳制时间250 ms，阶跃10mv，每次条件脉冲后紧跟一固定的去极化到+60mv的测试脉冲，持续时间250ms，刺激频率0.5hz（图5a）。以相对电流i/imax为纵坐标，膜电位为横坐标绘制失活曲线，也采用boltzmanne方程i/imax=1/{1+exp(v-v1/2)/k}进行拟合，式中得到ito失活曲线(图5)，然后求得半数最大失活电位(v1/2)和斜率因子(s)。6μg/g甘松挥发油使ito失活曲线明显左移(p< 0.01，n=5)。对照组半数最大失活电位(v1/2)为：(-33.738±0.476)mv，斜率因子(s)为：(5.001±0.396)mv；6μg/g甘松挥发油组半数最大失活电位(v1/2)为：(-40.536±0.696)mv，斜率因子(s)为：(8.420±0.620)mv(图5b)。

　 　4  讨论

    本实验结果表明甘松挥发油呈浓度和电压依赖性抑制大鼠心室肌细胞ito，随着浓度增加阻断作用增强，且使失活曲线明显左移，但对ito半数激活电压无明显影响。心脏电活动表现为心肌动作电位(action potential, ap)形成，包括除极和复极过程（ 0，1，2，3和4相）。心肌动作电位的形成需要多种离子通道的共同参与，0相是ina激活，细胞除极；1相是快速复极早期，ina失活和ito激活；2相(平台期)，内向电流有ica-l、慢ina等，外向电流有ik1、ik。快速复极期，ica-l失活，ik和ik1逐渐增强。3相复极的早期主要是ik的作用，后期ikl的作用增强。4期(静息期)，恢复到静息电位，ik1在维持静息电位中起重要作用［8］。心肌细胞中各种钾通道电流是使心肌细胞动作电位复极的主要电流，影响这些电流会明显改变复极过程，它们在0相除极以外的其他各项中均起到重要作用。

    瞬时外向钾电流(ito)是一种产生外向电流的电压依赖性钾通道，在哺乳动物心肌细胞上存在明显的瞬时外向钾电流，它是心肌细胞复极早期的重要离子流之一，其作用主要与动作电位的复极1相有关，该电流的大小对动作电位的形态和时程有较大影响［9］。ito分两型：ito1和ito2，ito1对4-氨基吡啶(4-aminopyridine)敏感，又称4-aminopyridine敏感型的瞬时外向钾电流；ito2依赖于肌浆网ca2+的释放，又称钙依赖性瞬时外向钾电流。本实验细胞外液中加入cdcl2以阻断细胞外钙离子内流和电极内液中含egta螯合细胞内钙离子，从而达到阻断ito2而记录ito1。通常所指的ito为ito1，与心律失常的发生关系密切。研究表明，ito1虽分布于所有心肌细胞膜，但在心房肌和心室肌外膜侧密度较高。在心室壁，从心内膜到心外膜，ito1密度逐渐增加，引起从心室内膜到外膜动作电位1相逐渐明显，导致两层细胞动作电位形态截然不同，心外膜动作电位有明显的尖峰和圆穹(spike and dome)，而心内膜细胞则没有［10］。这种分布的异质性是引起跨心肌壁复极不均一性的主要电流，也是引起2相折返导致室性心动过速和心室颤动的主要病理、生理机制［11］。理论上抑制ito应是 治疗 2相折返性心律失常的有效措施。

    本实验利用膜片钳技术，观察到甘松挥发油对心室肌细胞离子通道ito有明显的抑制作用，呈浓度和电压依赖性抑制大鼠心室肌细胞ito，使i-v曲线下移，同时，甘松挥发油对激活曲线没有明显影响，而使失活曲线明显左移，给药前后半数失活电压和失活斜率因子有显著统计学意义，提示甘松挥发油作用于通道的失活态而非静息态或激活态，能加快钾通道的失活，这样可能使心室肌细胞复极化减慢，延长动作电位有效不应期(erp delay)，从而产生抗心律失常作用，这也许是其抗心律失常作用机制之一。

【 参考 文献 】
  　　［1］江苏新医学院.中药大辞典，上册［m］.上海:上海 科学 技术出版社，1985: 566.

　　［2］杨医亚.中医学,第2版［m］.北京:卫生出版社,1984：184.

　　［3］唐其柱,黄峥嵘,史锡腾,等.甘松提取物对家兔心室肌细胞钠钙通道的影响［j］.中华心血管杂志,2004,32(22):267.

　　［4］ken tanaka,katsuko komatsu.comparative study on volatile components of nardostachys rhizome［j］.journal of natural medicines，2008，62:1340.

　　［5］ge yz,yeh jz,zhang xl.the effects of the volatile oil of gansong on the cardiac sodium［j］. clinical cardiology 2005,28:33.

　　［6］葛郁芝，吴志婷，叶政助，等.甘松挥发油对心肌细胞内向电流的影响［j］.心肺血管 论坛 ,2005,11（6）:41.

　　［7］中华人民共和国卫生部药典委员会.