作者：白一岑　李艳杰　马云淑 

【摘要】  ：目的 考察石菖蒲、肉豆蔻、橘皮所含挥发油对雪上一枝蒿总碱经皮渗透的影响。方法 采用改良franz扩散池法,以小鼠皮肤为透皮屏障,用hplc法测定模型药物雪上一枝蒿总碱中甲素的累积渗透量,并以氮酮为对照,考察不同浓度石菖蒲、肉豆蔻、橘皮所含3种挥发油对雪上一枝蒿甲素的促渗效果。结果 7%石菖蒲、7%肉豆蔻挥发油与3%氮酮对雪上一枝蒿总碱的促渗效果最好,渗透系数分别为5.88、6.91、5.30、5.75；与无促渗剂组相比,促渗倍数分别为1.09、1.28、0.98、1.06倍。结论 7%石菖蒲、7%肉豆蔻挥发油均能促进雪上一枝蒿甲素的经皮渗透,5%橘皮挥发油无明显促渗作用。

【关键词】  促渗剂　雪上一枝蒿　石菖蒲挥发油　肉豆蔻挥发油　橘皮挥发油

　　abstract：objective to investigate the effects of volatile oils of rhizoma acori tatarinowii (rat), semen myristicae (sm) and pericarpium citri reticulatae (pcr) on percutaneous penetration of total alkali of shortstalk monkshood root through mouse skin in vitro. methods by using an improved franz diffusion cells, the effects of these 3 kinds of volatile oil on the percutaneous penetration of total alkali of shortstalk monkshood root were observed and compared with azone, and the cumulative amount of bullatine a was determined by hplc. results 7% (v/v) volatile oil rta and sm, 5% (v/v) volatile oil of pcr and 3% (v/v) azone were best concentration, the penetration coefficient were 5.88, 6.91, 5.30, 5.75, respectively. compared with the group without penetration enhencers, the enhancement ratios were 1.09,1.28, 0.98, 1.06, respectively. conclusion the volatile oil of rat and sm enhance penetration of total alkali of shortstalk monkshood root. the volatile oil of pcr cannot enhance penetration.

　　key words：penetration enhancers；shortstalk monkshood root；volatile oil of rhizoma acori tatarinowii；volatile oil of semen myristicae；volatile oil of pericarpium citri reticulat

    　雪上一枝蒿总碱含有一枝蒿甲、乙、丙素等二萜类生物碱,是毛茛科植物雪上一枝蒿的主要成分,具有镇痛、抗炎、镇静的功效,民间和临床上常用雪上一枝蒿药材外敷治疗各类疼痛。WWw.11665.CoM本研究以雪上一枝蒿总碱为模型药,以石菖蒲、肉豆蔻、橘皮中所含挥发油为促渗剂,用氮酮进行阳性对照,并以雪上一枝蒿甲素为指标,考察对雪上一枝蒿总碱经皮渗透的影响,为芳香开窍药、理气药类中药促渗剂的研究与开发提供实验依据。

　　1  实验材料

　　1.1  动物

    昆明种小白鼠(云南中医学院实验动物中心提供,许可证号：2004-16),体重(20±2)g,雌雄兼用。

　　1.2  药物与试剂
  
　　雪上一枝蒿甲素对照品(中国药品生物制品鉴定所)；雪上一枝蒿甲素为毛茛科植物短柄乌头aconitum brachy podum diels.的主要成分(中国科学院昆明植物所提供,李锡文鉴定)；石菖蒲为天南星科多年生草本植物石菖蒲acorus gramineus soland.根茎；肉豆蔻为肉豆蔻科植物肉豆蔻myristica fragrans houtt.的成熟果仁；橘皮为芸香科植物橘citrus reticulata blanco的栽培变种的成熟新鲜果皮(云南省药材公司,由云南中医学院生药教研室鉴定)。8% na2s溶液、生理盐水、70%乙醇、磷酸盐缓冲液,均为分析纯、甲醇为色谱纯。

　　1.3  仪器

　　tk-12b透皮扩散试验仪,上海锴凯科技贸易有限公司产品；高效液相色谱仪,德国agilent1100series(dad)；电子分析天平(precisa xs125a,d＝0.000 1 g)；kudos-sk250hp超声仪(上海科导超声仪器有限公司)。

　　2  实验方法

　　2.1  挥发油提取

    　石菖蒲经水蒸气蒸馏得到淡黄色的油状液体,收率为0.6%；肉豆蔻经水蒸气蒸馏后得到淡黄色油状液体,收率为1.36%；橘皮经水蒸气蒸馏得到近无色油状液体,收率为0.66%。

　　2.2  供试液的配制

    　精密称取雪上一枝蒿总碱,用少量稀盐酸(ph＝1)溶解,加入70%乙醇定容,配成浓度为30 mg/ml的空白雪上一枝蒿甲素溶液。同法另配4份,分别加入氮酮、石菖蒲、肉豆蔻以及橘皮挥发油,配制成不同浓度的供试药液。实验时,取上述5份样品液各1 ml,放入供给池进行透皮扩散实验。

　　2.3  高效液相色谱法测定雪上一枝蒿甲素含量

　　2.3.1  色谱条件

　　色谱柱：eclipse xdb-c18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液(10∶90)；流速：1.0 ml/min；波长为214 nm。在此条件下,样品峰分离较好,且挥发油无干扰,色谱图见图1、图2。样品中雪上一枝蒿甲素的保留时间为8.5 min,分离度大于1.5。

　　2.3.2  标准曲线的制定 

　　精密称取一定量的雪上一枝蒿甲素,用少量稀盐酸(ph＝1)溶解,12 h空白皮肤液定容,配成一系列不同浓度的溶液(0.013、0.065、0.13、0.26、0.39、1.04 mg/ml),进样量10 μl。以峰面积为横坐标,进样量(mg/ml)为纵坐标,进行线性回归,得回归方程：y＝2 058.6x－13.555,r＝0.999 9,线性范围为0.013～1.04 mg/ml。

　　2.3.3  回收率试验 

　　取12 h已知浓度的样品皮肤透过液6份,加入一定量的雪上一枝蒿甲素对照品,测定浓度,平均回收率为99.89%,rsd＝0.019 6%。

　　2.3.4  精密度试验 

　　用0.26 mg/ml对照品溶液连续测定6次,计算浓度,rsd＝0.003%。

　　2.3.5  稳定性试验 

　　用0.26 mg/ml对照品溶液于不同时间分别进样5 μl。日内稳定性于0、1、2、4、6、8、10、24 h进样,计算浓度,rsd＝0.011 8%。日间稳定性于1、2、3、4、5、6 d进样,计算浓度,rsd＝0.014 7%。

　　2.4  离体皮肤的制备
   
　　将小鼠断颈处死,取腹部皮肤,去掉皮下脂肪,用生理盐水洗净,浸泡,置冰箱中冷藏备用。

　　2.5  透皮试验[1]
   
　　将处理好的皮肤置于franz扩散池、供给池和接受池结合处,使角质层面向供给池,用弹簧夹固定,接收池中加入生理盐水,在供给池中加入按“2.2”项下配制的供试液1 ml进行体外透皮实验,在0.5、1、1.5、2、4、6、8、12 h时将接受液全部取出(7 ml),同时补加7 ml接受液并排尽气泡。以空白皮肤为随行对照,氮酮为阳性对照,不含挥发油的乌头碱供试液为阴性对照。透皮扩散实验仪温度(37±0.2)℃,磁搅拌子转速(250±5)r/min,用高效液相色谱法测定样品浓度。

　　2.6  结果处理
   
　　根据下式求得累积渗透量qn＝(cn×7＋ )/2.92,公式中cn为第n个取样点测得的药物浓度；ci为第i个取样点测得的药物浓度。以累积渗透量q对时间t作图,药物渗透达到稳态后,其中直线部分的斜率为药物的透皮速率,即稳态渗透速率(jss),药物的渗透系数(kp)按kp＝jss/c计算,c为供给池的药物浓度[2],增渗倍数(enhancementratio,er)可从下式得到：er＝kp/kp0[3],kp为加促渗剂后药物的渗透系数,kp0为药物固有的渗透系数。

　　3  结果

　　3.1  不同浓度的石菖蒲、肉豆蔻、橘皮挥发油对雪上一枝蒿总碱透皮吸收的影响
   
　　取“2.2”项下配制的供试液1 ml,按“2.5”项所述实验方法进行实验。结果见表1。表1  不同浓度石菖蒲、肉豆蔻、橘皮挥发油对雪上一枝蒿总碱中甲素的累积渗透量（略）

　　3.2  最佳浓度石菖蒲、肉豆蔻、橘皮挥发油对雪上一枝蒿总碱透皮吸收的影响
   
　　分别配制含3%氮酮、7%肉豆蔻、7%石菖蒲、5%橘皮挥发油的雪上一枝蒿总碱溶液,按“2.5”项所述方法进行实验。测定接受池皮肤透过液中雪上一枝蒿甲素的含量,计算其累积渗透量、渗透系数、增渗倍数等,结果见表2、表3。表2  石菖蒲、肉豆蔻、橘皮挥发油对雪上一枝蒿总碱中甲素的渗透系数、增渗倍数的影响(略)表3  雪上一枝蒿总碱溶液中甲素的累积渗透量(略)

 　   结果表明,12 h的平均累计透过量大小为：肉豆蔻油>石菖蒲油>橘皮油。肉豆蔻油的增渗倍数是不含促渗剂的1.28倍,石菖蒲油为1.09倍,橘皮油为0.98倍,氮酮为1.06倍。3种挥发油均能促进雪上一枝蒿甲素的经皮渗透,但肉豆蔻油、石菖蒲油与氮酮相比无显著性差异,而橘皮油促渗效果不如氮酮。

　　4  讨论

   　 在接收液测定方法的选择中,曾按部颁标准使用溴甲酚绿酸性染料比色法,以紫外分光光度计检测其渗透量,因误差大影响实验结果,因此改用高效液相色谱法测定其渗透量。曾选用甲醇-磷酸盐缓冲液系统,但甲醇在该波长下有吸收,基线不平；改为乙腈-磷酸盐缓冲液系统后,出峰时间适宜,理论塔板数均大于6 000,分离度大于2。

  　  药物组在12 h累积渗透量一直有增加,而加入促透剂后6 h内线性关系较好,符合higuchi方程。为了体现实验的准确性,选择6 h的累积渗透量、6 h的透皮速率常数为透皮参数。

　    从实验结果可以看出,石菖蒲、肉豆蔻挥发油作用于皮肤后,使雪上一枝蒿总碱渗透系数,增渗倍数均增大,说明这些挥发油对雪上一枝蒿总碱的经皮渗透具有一定促进作用。2种挥发油组与氮酮组相比,前2 h的累积渗透量少于氮酮组,而2 h后累积渗透量明显高于氮酮组。

 　   挥发油中所含萜类化合物具有较好的促渗作用[4],我们通过gc-ms分析,石菖蒲挥发油主要成分为β-细辛脑、莰烯、龙脑；肉豆蔻挥发油主要成分为香桧烯、黄樟油素、β-水芹烯、1,8-桉叶素；橘皮挥发油主要成分为柠檬烯、γ-松油烯、月桂烯,与理气药陈皮主要成分相同[5],功效相似。因鲜品橘皮挥发油含量较陈皮高,因此选用鲜品提取挥发油。这些成分均为单萜和倍半萜,有一定的促渗作用。橘皮对一枝蒿总碱的无明显的促渗作用,可能各成分之间的配比对促渗结果有一定的影响,其中具促渗作用的主要成分及其构效关系还值得进一步研究。

【参考文献】
  　　[1] 马云淑,赵浩如.葛根素及其磷脂复合物的体外透皮实验研究[j].中国中药杂志,2000,25(5)：274－276.

　　[2] gao s, singh j.mechanism of transdermal transport of 5-fluorouracil by terpenes：carvone, 1,8-cineole and thymol[j]. int j pharm,1997, 154：67.

　　[3] williams ac, barry bw. terpenes and the lipid-protein- partitioning theory of skin penetration enhancement[j]. pharm res, 1991,8(1)：17.

　　[4] 梁秉文.中药经皮给药制剂技术[m].北京：化学工业出版社,2006.81.

　　[5] 董 岩,崔庆新,魏兴国.陈皮挥发油化学成分气相色谱-质谱分析[j].山东中医杂志,2004,23(6)：371