作者：杨慧文，王晓可，毋福海
【摘要】 目的 建立栀子金花丸中黄芩苷的含量测定方法。方法 采用未涂层弹性融硅石英毛细管柱(60 cm× 75 μm，有效长度52 cm)，以40 mmol·l-1硼砂溶液(ph9.0)为运行缓冲液;分离电压为12 kv;重力进样10 s(高度15 cm);检测波长为280 nm;以对硝基苯甲酸为内标。结果 黄芩苷质量浓度在7.5～52.5 μg·ml-1范围内具有良好的线性关系(r=0.999 6)，黄芩苷平均回收率为96.7%，rsd值为1.62%(n=6)。结论 该方法专属性强，结果准确可靠、重现性好，可用于栀子金花丸的质量控制。
【关键词】 毛细管电泳法;栀子金花丸;黄芩苷
abstract:objective to establish the method for the determination of baicalin in zhizijinhua pills by capillary electrophoresis. methods the separation was performed in an uncoated fused silica capillary of 60 cm×75 μm id (52 cm effective length).the running buffer wes 40 mmol·l-1 na2b4o7 buffer solution(ph9.0).the voltage applied was 12 kv. the sample was injected by gravity(10 s，15 cm). the detection wavelength was 280 nm,and the internal standard was pnitrobenzoic acid. results the linear range of baicalin was 7.5-52.5 μg·ml-1(r=0.999 6). the average recovery for baicalin was 96.7%(rsd=1.62%,n=6). conclusion the method proved to be exclusive,convenient,rapid and well repeatable，and can be used for quantitative determination of zhizijinhua pills.
key words:capillary electrophoresis;zhizijinhua pills;baicalin
栀子金花丸是由栀子、黄芩、黄连、黄柏等8味药材制成的中药成方制剂，具有清热泻火、凉血解毒之功效。WWW.11665.coM临床用于肺胃热盛，口舌生疮，牙龈肿痛，目赤眩晕，咽喉肿痛，吐血衄血，大便秘结等的 治疗 。栀子金花丸的现行标准采用hplc法测定制剂中栀子苷的含量[1]，亦有其他 文献 报道采用hplc法测定其中黄芩苷、栀子苷、绿原酸等成分的含量 [2～6]，但采用毛细管电泳法对栀子金花丸进行质量控制的方法尚未见报道。本文采用毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷的含量，为更好地控制栀子金花丸质量提供了依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
cl1030型高效毛细管电泳仪(北京彩陆 科学 仪器有限公司)，knauer k2501紫外-可见检测器(德国)，hw2000色谱工作站2.17版(南京千谱软件有限公司)。orion model 828型ph计(美国)。dl360超声波清洗器[宁波石浦海天 电子 仪器厂，频率(4.5±0.225)khz，功率240 w]。未涂层弹性融硅石英毛细管柱(河北锐年永沣色谱器件有限公司)。
1.2 试药
黄芩苷( 中国 药品生物制品检定所，批号110715-200815)。栀子金花丸(山东孔圣堂制药有限公司，批号090457、090546、090741，规格 9 g·袋-1)。甲醇为色谱纯;硼砂、对硝基苯甲酸、naoh均为分析纯;水为双蒸水。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 内标溶液的制备 精密称取对硝基苯甲酸适量，加水制成100 μg·ml-1的内标贮备液。
2.1.2 对照品贮备液的制备 精密称取在60 ℃减压干燥4 h的黄芩苷对照品15 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(黄芩苷质量浓度为150 μg·ml-1)。
2.1.3 供试品溶液的制备 取栀子金花丸样品，研碎，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%(体积分数)甲醇50 ml，称定重量，超声处理40 min，放冷，再称定重量，用70%(体积分数)甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10 ml至蒸发皿中，水浴挥干，再用70%(体积分数)甲醇溶解转移至10 ml量瓶中，加入内标溶液2.5 ml，用70%(体积分数)甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
2.1.4 阴性对照液的制备 取处方组成中除黄芩外的其余药材，制成不含黄芩的阴性对照品，按“2.1.3”项下方法处理，即得。
2.1.5 运行缓冲液的制备 精密称取硼砂适量，加水制成40 mmol·l-1硼砂溶液(ph=9.0)，0.45 μm微孔滤膜滤过，作为运行缓冲液。
2.2 电泳条件
采用未涂层弹性融硅石英毛细管柱(60 cm×75 μm，有效长度52 cm);以40 mmol·l-1硼砂溶液(ph9.0)为运行缓冲液;分离电压为12 kv;重力进样10 s(高度15 cm);检测波长为280 nm;温度为室温，湿度小于70%。毛细管柱在使用前依次用0.1 mol·l-1 naoh溶液和水冲洗15～20 min，再用运行缓冲液冲洗约5 min。以对硝基苯甲酸为内标。在此条件下进行测定，对照品、供试品、阴性对照溶液色谱图见图1。
2.3 方法学考察
2.3.1 标准曲线的制备 分别吸取对照品贮备液适量，加甲醇稀释成黄芩苷质量浓度为7.5、15.0、22.5、30.0、37.5、45.0、52.5 μg·ml-1，内标物质量浓度为25.0 μg·ml-1的溶液。依次重力进样10 s，每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标(y)，黄芩苷质量浓度(ρ)为横坐标进行线性回归，得回归方程y=0.0350ρ-0.0383，r=0.999 6。表明黄芩苷在7.5～52.5 μg·ml-1范围内线性关系良好。
2.3.2 精密度试验 取质量浓度为30.0 g·ml-1的黄芩苷对照品溶液，按“2.2”项下电泳条件，连续测定5次，记录峰面积并 计算 rsd值。结果黄芩苷峰面积的rsd=1.99%，表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液(批号090741)，在0、2、4、6、8、12 h分别重力进样10 s，记录峰面积并计算rsd。结果黄芩苷峰面积的rsd=1.65%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.3.4 重复性试验 取同一批号(批号090741)的栀子金花丸样品6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定。结果栀子金花丸中黄芩苷的平均含量为1.63 mg·g-1，rsd=1.62%(n=6)。表明重复性良好。
2.3.5 加样回收率试验 精密称取栀子金花丸样品(批号090741)共6份，加入黄芩苷对照品适量，按“2.1.3”项下方法处理并依法测定，计算回收率，结果见表1。栀子金花丸中黄芩苷的平均回收率为96.7%,rsd=2.15%。表1 加样回收率试验
2.4 样品测定
取栀子金花丸样品3批，按“2.1.3”项下方法处理后依法测定，记录峰面积，代入回归方程计算样品中黄芩苷的含量，结果见表2。表2 样品含量测定
3 讨论
3.1 提取方法的选择 参考 有关文献[7，8]中黄芩苷的提取方法，本实验先后以50%(体积分数)甲醇、70%(体积分数)甲醇、甲醇为溶剂进行超声提取。结果表明，样品采用70%(体积分数)甲醇超声提取基本完全，且黄芩苷与杂质峰分离度较好。同时考察了不同提取时间(30、40、50 min)对提取效率的影响，结果显示超声40 min时提取率已达最高，超声时间延长而提取率并未提高。因此，确定以70%(体积分数)甲醇为提取溶剂，超声提取40 min。
3.2 内标物的选择 毛细管电泳有重现性差的缺点，因此采用内标法定量。苯甲酸钠、对氨基苯甲酸以及对硝基苯甲酸在280 nm波长处均有吸收。预实验结果表明，苯甲酸钠在体系中不出峰;对氨基苯甲酸灵敏度低，且出峰时间与黄芩苷过于接近，容易产生干扰;对硝基苯甲酸峰型好，虽出峰时间与黄芩苷接近，但在样品中无干扰，故选其作为内标物。
3.3 运行缓冲液的选择[9] 黄芩苷极性较强，容易离子化;而在硼砂溶液中，黄芩苷中邻二羟基基团更易形成络离子[10]，加快离子化。因此选择硼砂溶液为运行缓冲液，并通过实验确定其最佳浓度为40 mmol·l-1。
3.4 采用毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷含量，与高效液相色谱法相比[1，5，6]具有样品用量少，分析成本低等优点，并减少了对环境的污染，可用于栀子金花丸的质量控制。
【参考文献】
[1] 国药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部[m].北京：
2.3 方法学考察
2.3.1 标准曲线的制备 分别吸取对照品贮备液适量，加甲醇稀释成黄芩苷质量浓度为7.5、15.0、22.5、30.0、37.5、45.0、52.5 μg·ml-1，内标物质量浓度为25.0 μg·ml-1的溶液。依次重力进样10 s，每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标(y)，黄芩苷质量浓度(ρ)为横坐标进行线性回归，得回归方程y=0.0350ρ-0.0383，r=0.999 6。表明黄芩苷在7.5～52.5 μg·ml-1范围内线性关系良好。
2.3.2 精密度试验 取质量浓度为30.0 g·ml-1的黄芩苷对照品溶液，按“2.2”项下电泳条件，连续测定5次，记录峰面积并 计算 rsd值。结果黄芩苷峰面积的rsd=1.99%，表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液(批号090741)，在0、2、4、6、8、12 h分别重力进样10 s，记录峰面积并计算rsd。结果黄芩苷峰面积的rsd=1.65%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.3.4 重复性试验 取同一批号(批号090741)的栀子金花丸样品6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定。结果栀子金花丸中黄芩苷的平均含量为1.63 mg·g-1，rsd=1.62%(n=6)。表明重复性良好。
2.3.5 加样回收率试验 精密称取栀子金花丸样品(批号090741)共6份，加入黄芩苷对照品适量，按“2.1.3”项下方法处理并依法测定，计算回收率，结果见表1。栀子金花丸中黄芩苷的平均回收率为96.7%,rsd=2.15%。表1 加样回收率试验
2.4 样品测定
取栀子金花丸样品3批，按“2.1.3”项下方法处理后依法测定，记录峰面积，代入回归方程计算样品中黄芩苷的含量，结果见表2。表2 样品含量测定
3 讨论
3.1 提取方法的选择 参考 有关 文献 [7，8]中黄芩苷的提取方法，本实验先后以50%(体积分数)甲醇、70%(体积分数)甲醇、甲醇为溶剂进行超声提取。结果表明，样品采用70%(体积分数)甲醇超声提取基本完全，且黄芩苷与杂质峰分离度较好。同时考察了不同提取时间(30、40、50 min)对提取效率的影响，结果显示超声40 min时提取率已达最高，超声时间延长而提取率并未提高。因此，确定以70%(体积分数)甲醇为提取溶剂，超声提取40 min。
3.2 内标物的选择 毛细管电泳有重现性差的缺点，因此采用内标法定量。苯甲酸钠、对氨基苯甲酸以及对硝基苯甲酸在280 nm波长处均有吸收。预实验结果表明，苯甲酸钠在体系中不出峰;对氨基苯甲酸灵敏度低，且出峰时间与黄芩苷过于接近，容易产生干扰;对硝基苯甲酸峰型好，虽出峰时间与黄芩苷接近，但在样品中无干扰，故选其作为内标物。
3.3 运行缓冲液的选择[9] 黄芩苷极性较强，容易离子化;而在硼砂溶液中，黄芩苷中邻二羟基基团更易形成络离子[10]，加快离子化。因此选择硼砂溶液为运行缓冲液，并通过实验确定其最佳浓度为40 mmol·l-1。
3.4 采用毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷含量，与高效液相色谱法相比[1，5，6]具有样品用量少，分析成本低等优点，并减少了对环境的污染，可用于栀子金花丸的质量控制。
【参考文献】
[1] 国药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部[m].北京：
