【摘要】 本实验利用透析袋平衡透析、毛细管电泳ru(bpy)２＋3电化学发光检测技术测定了丙吡胺和人血浆蛋白的结合率。在恒电位1.3 v；进样电压10 kv持续10 s，分离电压15 kv，运行缓冲液30 mmol/l 磷酸盐缓冲液（ph 7.5），检测池中为5 mmol/l ru(bpy)２＋3 稀释于50 mmol/l 磷酸盐缓冲液（ph 7.5)中等最优化的条件下，丙吡胺的检出限为10 μmol/l(s/n=3)。对蛋白结合率的测定结果表明，人血浆中的药物浓度为1.6～8.2 mmol/l，丙吡胺与血浆蛋白的结合是呈线性的，其线性回归方程为y=－0.07+0.93x，线性相关系数r为0.9999，丙吡胺与人血浆蛋白的结合率约为90.4%。
【关键词】 毛细管电泳 电化学发光 丙吡胺 血浆蛋白结合率 平衡透析
1 引言
毛细管电泳(capillary electrophoresis,ce)是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分析分离技术［１］，自诞生以来[1]，在蛋白质和多肽［２］、氨基酸[３]、药物[４，５]等分子的分离分析方面显示了强大的应用前景。它具有高效、快速、分析对象广、试剂消耗少、环境友好等优点。因为ce的进样量少，所以需要发展一种与之相匹配的高灵敏度的检测方法。wWw.11665.Com而电化学发光(electrochemiluminescence,ecl)检测正响应了这一需求，它是化学发光和电化学过程的结合，由于其较低的背景信号而使得被分析物的检出限低、线性范围宽[６]。电化学发光体系中采用较多的是三联吡啶钌(ru(bpy)２＋3)反应体系，ru(bpy)２＋3在ecl反应中具有电化学可逆性和较好的稳定性。其ecl同ce联用已应用于药物分析以及药物与蛋白结合作用的研究中[７～10]。
丙吡胺(disopyramide,dp)是一种有效地预防和治疗抗心律失常的药物[11]。对药物蛋白的结合作用的研究有着重要的临床价值，因为游离药物的浓度会影响药物分布以及药物效应[12]。药物蛋白结合率是药物动力学的重要参数之一， 研究药物和蛋白作用的方法主要包括平衡透析、超滤、核磁共振光谱、质谱、色谱、毛细管电泳等方法[13]，其中测定药物游离浓度最常使用的方法是平衡透析[14]。本实验采用传统的平衡透析方法，利用ceecl技术测定了ｄｐ对人血浆蛋白的结合率。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
mpia型毛细管电泳电化学发光检测仪(西安瑞迈分析仪器有限公司，中科院长春应用化学研究所)，该仪器由数控毛细管电泳高压电源、多功能化学发光分析仪、电化学分析仪三部分组成，并与计算机联用。本实验使用了50 cm长、内径为25 μm的未涂层的熔融石英毛细管(河北永年光纤厂)。ceecl检测池已有报道[15]。柱端ecl检测池中采用了传统的三电极体系：ф500 μm pt圆盘电极作为工作电极、pt丝为对电极、ag/agcl (饱和kcl)为参比电极。工作电极和毛细管出口端在显微镜下(×40)调整为准直，其距离为125 μm。
ru(bpy)２＋3 (aldrich, 美国milwaukee公司)，丙吡胺（dp，美国sigma公司)。其它试剂均为分析纯。透析袋(8000 da)(上海amersham公司)。实验用水经milliq 系统(美国millipore公司)纯化。用于毛细管电泳所有溶液均放置于4 ℃冰箱，并且进样前先用0.22 μm滤膜(上海新亚净化材料厂)进行过滤。
2.2 实验方法
新毛细管充入1 mol/l naoh浸泡１２ h。活化后，毛细管使用前先用0.1 mol/l naoh冲洗10 min，然后用水冲洗10 min，最后用电泳运行缓冲液冲洗10 min。每次实验前，在ecl检测池中加入约600 μl 5 mmol/l ru(bpy)２＋3(配制在50 mmol/l pbs(ph 7.5）中)。ecl信号由mpia系统记录。光电倍增管高压设置为－850 v，恒电位为1.3 v，进样电压为10 kv，进样时间10 s，运行电压为15 kv。运行缓冲液为30 mmol/l ｐｂｓ(ph 7.5)。
2.3 丙吡胺与血浆的反应
2.3.1 平衡时间的测定 取100 μl 0.01 mol/l dp与90 μl血浆混合，在37 ℃下孵育透析，透析袋外为4 ml 30 mmol/l pbs(ph 7.5)。每隔0.5 h，取100 μl透析袋外的溶液，测定其ecl强度，直到ecl强度达到稳定。
2.3.2 给药量与结合药物量的关系测定 取一系列体积0.05 mol/l dp与90 μl的血浆混合，37 ℃时孵育透析，透析袋外为4 ml pbs 30 mmol/l（ph 7.5)。达到平衡后，分别取透析袋外溶液100 μl测定其ecl强度。
3 结果与讨论
3.1 检测池ph值的优化
对于ceecl检测，许多检测条件如缓冲溶液、检测电位，进样量等都对待测物ecl强度存在影响。其中，检测池ph对ecl信号的强度影响很大，因为ru(bpy)２＋3与共反应物之间的反应依赖于ph，最大ecl峰强通常在稍显碱性的条件下取得[16]。实验考察了柱端检测池中缓冲溶液的ph对ecl强度的影响。dp的浓度为300 μmol/l，运行缓冲溶液为30 mmol/l pbs (ph 7.5)。检测池中为5 mmol/l ru(bpy)２＋3 (配制在50 mmol/l pbs中)，选择ph值从5.2～9.0之间对ph进行优化(见图1)，当ph 5.2～7.0时，ecl信号一直在增加。ph 7.0～7.5时，ecl强度几乎是一个平台。ph＞7.5后，ecl峰强逐渐下降。本实验选择检测池的ph为7.5。
图1 ph 对ecl强度的影响（略）
fig.1 effect of ph on electrochemiluminescence (ecl) intensity
300 μmol/l disapyramide(dp); 电动进样(electrokinetic injection): 10 kv×10 s；分离电压（separation voltage）: 15 kv; 检测电位(detection potential): 1.3 v；运行缓冲液(running buffer): 30 mmol/l pbs, ph 7.5; 检测溶液(detection solution): 5 mmol/l ru(bpy)２＋3溶于50 mmol/l pbs(5 mmol/l ru(bpy)２＋3 in 50 mmol/l pbs)。
由于ru(bpy)２＋3 的氧化电位在1.15 v左右，实验中采用了略高于其氧化电位的1.3 v作为检测电位；实验中发现，ecl强度随ru(bpy)２＋3浓度增加而不断增大，ru(bpy)２＋3浓度达到5 mmol/l并继续增大时，ecl强度趋于饱和，故实验中采用5 mmol/l ru(bpy)２＋3。
3.2 丙吡胺的电泳图
丙吡胺的电泳图如图2所示。以30 mmol/l pbs (ph 7.5)稀释得到了100、300、500、700和1000 μmol/l ｄｐ标准溶液。检测池中为5 mmol/l ru(bpy)2+５溶于50 mmol/l pbs (ph 7.5)中，运行缓冲溶液为30 mmol/l pbs (ph 7.5)。dp的出峰时间约6 min，可以看出，随着dp浓度的升高，其峰强逐渐增大。
图2 丙吡胺的电泳图（略）
fig.2 electropherograms of dp
dp (μmol/l): 1. 100； 2. 300； 3. 500； 4. 700； 5. 1０００; 其它条件同图1（other conditions were same as fig.1）。
3.3 丙吡胺的线性范围、检出限及重现性
在恒电位1.3 v；进样电压10 kv持续10 s；分离电压15 kv；运行缓冲液30 mmol/l ｐｂｓ（ph 7.5）；检测池中为5 mmol/l ru(bpy)２＋3 稀释于50 mmol/l pbs中（ph 7.5)，以30 mmol/l pbs（ph 7.5）稀释得到100 μmol/l dp溶液，进样6次测定其峰高与时间的rsd分别为4.94%、0.24%。用30 mmol/l pbs(ph 7.5)配制了一系列标准溶液测定dp的线性范围，得到其线性范围10～1000 μmol/l，线性回归方程为y=78.87+2.34×103x, 其中y为ecl强度，x为dp的浓度；r为0.9947。检出限为10 μmol/l(s/n=3)。
3.4 丙吡胺与血浆蛋白的反应平衡时间的测定
本实验采取平衡透析的方法来研究dp与血浆蛋白间的作用，采用正常人体温37 ℃为反应温度，其达到平衡所需要的时间通过ceecl表征得到。取100 μl 0.01 mol/l dp与90 μl 血浆混合，在37 ℃下孵育透析，透析袋外为4 ml 30 mmol/l pbs (ph 7.5)。每隔0.5或1.0 h，取透析袋外溶液100 μl测定其ecl强度。为了减少仪器带来的误差，每次测透析袋外溶液时先测定250 μmol/l dp溶液(总的ecl强度)，得到的相对ecl强度可以通过为透析袋外dp的ecl强度与总的ecl强度的比值。
如图3所示，随着反应时间的增加，相对ecl强度逐渐增大，大约4 h后，达到一个平台(60%)，表明反应达到平衡。
图3 相对ecl强度随时间的变化（略）
fig.3 relationship between relative ecl intensity and time
孵育温度（incubation temperature）, 37 ℃; 透析袋外溶液(solution inside dialysis bag): 100 μl 0.01 mol/l dp及90 μl血浆蛋白(plasma protein); 透析袋外溶液(solution outside dialysis bag): 4 ml 30 mmol/l pbs (ph 7.5); 其它条件同图1(other conditions were the same as fig.1）。
3.5 丙吡胺结合浓度与血浆中总药浓度之间的关系
取一系列体积的0.05 mol/l dp溶液与90 μl血浆混合，将这一系列透析袋在37 ℃下孵育透析，透析袋外为4 ml 30 mmol/l pbs (ph 7.5)。大约4 h反应平衡后，分别取透析袋外溶液100 μl测定其游离的ecl强度。
在平衡透析的过程中，血浆蛋白以及结合型的药物都不能透过透析袋，只有游离的药物dp才能透过透析袋，所以在达到透析平衡后，透析袋内游离型的药物浓度等于透析袋外游离型药物的浓度。袋内蛋白结合型的dp浓度为药物总量减去游离药物 (即透析袋内游离药物量与透析袋外药物量之和) 的差值除以透析袋内溶液的体积。
药物的血浆蛋白结合率是指血浆中与血浆蛋白结合的结合型药物占血浆中该药物总含量的百分比。
在透析袋中加入不同体积的0.05 mol/l dp和90 μl血浆蛋白,此透析袋浸入4 ml 30 mmol/l pbs (ph 7.5)中，在37 ℃下反应4 h; 取袋外溶液进行ecl测定。
人血浆中dp的浓度为1.6 ～ 8.2 mmol/l时，dp与血浆蛋白的结合是呈线性的，线性回方程为y=0.93x－0.07，其中x为袋内dp的总浓度，y为袋内蛋白结合型dp的浓度。相关系数r为0.9999。dp与血浆蛋白的结合率测定结果见表1，５次测定的平均值为90.4%，即dp与人血浆蛋白的结合率为90.4%。
表1 丙吡胺与人血浆蛋白结合率测定结果（略）
table 1 protein binding rate of disopyramide with human plasma protein
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