作者：谭峻英，谢媛，柯晓燕，李钟
【摘要】 目的 建立甘草水制广地龙饮片的质量标准。方法 按2005年版《 中国 药典》附录ⅸh水分测定法中的第一法、附录ⅸk灰分测定法和附录ⅹa浸出物测定法测定;采用hplc法测定饮片中的次黄嘌呤和肌苷的含量。结果 甘草水制广地龙饮片质量标准为：水分含量≤5.0%，总灰分含量≤10.0%，酸不溶性灰分含量≤5.0%，水溶性浸出物浓度≥20.0%，乙醇浸提物浓度≥8.0%;次黄嘌呤含量≥0.006%，肌苷含量≥0.40%。结论 建立了较完善的甘草水制广地龙饮片的质量标准，改变了过去仅依靠经验和感官判断的鉴定方法。
【关键词】 甘草水制广地龙;水分测定;灰分测定;浸出物测定;次黄嘌呤;肌苷
abstract:objective to establish a quality standard for the liquorice processed pheretima aspegillum.methods samples were determined according to the procedures recorded in the appendix ⅸh, ⅸk and ⅹa of chinese pharmacopoeia(2005), for moisture, ashes and extracts determination respectively, and the content of hypoxanthine and inosine was determined by hplc.results temporary quality standards were established that the moisture in p. aspegillum should be less than 5.0%, with the total ashe content below 10.0%, acid insoluble ashe content lower than 5.0%, the content of water extract higher than 20.0%, and the ethanol extract should be higher than 8.0%, hypoxanthine higher than 0.006%, and inosine higher than 0.40%.conclusion this research changed traditional methods of judging quality based on experiences and senses, and established a good quality standard for the liquorice processed p. aspegillum.
key words:liquoriceprocessed pheretima aspegillum; moisture determination; ashes determination; extract determination; hypoxanthine; inosine
广地龙是钜蚓科动物参环毛蚓 pheretima aspegillum (e.pettier)的干燥体，主产于广东和广西，为广东的道地药材[1]。www.11665.com其性咸寒，有清热、平肝、正喘、通络之功效，主治高热狂躁、惊风抽搐、风热头痛、目赤、中风半身不遂、喘息等疾病[2]。历代医家所用的地龙炮制品众多，在广东及香港现广泛应用甘草水制广地龙饮片，其目的是使其质地松脆、增效减毒、矫臭矫味以便于煎制服用。近代研究发现次黄嘌呤是广地龙平喘主要有效成分之一，有扩张支气管作用，并能对抗组胺及毛果芸香碱引起的支气管收缩发挥平喘作用[3]。肌苷又称为次黄嘌呤核苷，在酸性及高温条件下容易分解为次黄嘌呤等有关物质[4]。据研究发现：广地龙越粗壮，其饮片中的肌苷含量越高[5]。2005年版《中国药典》中“地龙”的[炮制]项下只收录了生地龙一种，且地龙的常规检查项目下没有收载醇溶性浸出物检查和有效成分的含量测定。目前尚未制定甘草水制广地龙的质量标准，现有 文献 多为对广地龙饮片中的琥珀酸[6]和次黄嘌呤等成分[7～9] 进行含量测定, 甘草水制广地龙饮片的质量控制仍停留在经验或古法的基础上。因此，为了保证甘草水制广地龙这种地方习用炮制品的质量，本实验采用常规检查结合hplc法测定饮片中的次黄嘌呤和肌苷含量的方法，对甘草水制广地龙饮片进行质量标准研究。
1 仪器与试药
广地龙为博罗先锋药业广地龙gap基地提供，经广东药学院刘基柱副教授鉴定为钜蚓科动物参环毛蚓pheretima aspegillum(e.pettier)的干燥体;甘草为市售药材，经广东药学院中药学院刘基柱副教授鉴定为豆科植物甘草glycyrrhiza uralensis fisch.的干燥根。炮制品由本实验室加工，标本保存在广东药学院药用植物与中药鉴定学教研室。次黄嘌呤对照品(140661200402)与肌苷对照品(140669200401)均购于中国药品生物制品检定所;甲醇为色谱醇;水为超纯水;其它试剂为分析纯。
高效液相色谱仪(上海天美organizer lc 2050; uv detector lc2010;pump lc2130);dl360a超声波清洗器(上海之信仪器有限公司，59 khz,250 w); 1013a电热鼓风恒温干燥箱(上海迅能电热设备有限公司)。
2 方法与结果
2.1 炮制品的制备 将广地龙饮片用10%的甘草水闷透，置炒制容器内，用文火炒干，炒至广地龙表面成棕色，取出，放凉。
2.2 性状鉴别 呈薄片状，长3～4 cm，宽约1 cm，边缘略卷。具环节，背部棕褐色至紫灰色，腹部浅黄棕色;生殖带较光亮。体轻，略呈革质，质韧不易折断。气腥，味微甘、咸。
2.3 显微鉴别 粉末棕黄色。表皮细胞为黄棕色，细胞界限不明显，有暗棕色的色素颗粒散在。肌纤维多，为透明或淡棕色，直径大约6～28 μm，大多离散，细长，多弯曲，有的局部膨大，明暗相间纹理不明显。刚毛少见，常破碎散在，淡棕色或黄棕色，中部直径大约28～33 μm，先端多钝圆，有的表面可见纵裂纹，偶见皮样纹理。
2.4 薄层鉴别 同《中国药典》2005年版“地龙”药材项下[1]方法。
2.5 常规检查[1]
2.5.1 水分测定 甘草水制广地龙饮片中挥发性成分较少，故采用《中国药典》2005年版一部(附录ⅸ h第一法)测定。
2.5.2 总灰分、酸不溶性灰分测定 按《中国药典》2005年版一部(附录ⅸk)方法测定。
2.5.3 浸出物测定 按《中国药典》2005年版一部(附录ⅹa)浸出物测定法测定。包括水溶性浸出物测定和醇溶性浸出物测定。供试品需粉碎，使能通过二号筛，并混合均匀，醇溶性浸出物测定采用冷浸法,乙醇体积分数为95%。以上常规检查项目结果见表1。根据实验结果分析，建议在制定甘草水制广地龙饮片质量标准时，以含水量不超过5.0%，总灰分不超过10.0%，酸不溶性灰分不超过5.0%，水溶性浸出物不得少于20.0%，醇溶性浸出物不得少于8.0%为宜。表1 甘草水制广地龙饮片常规检查项目结果
2.6 含量测定
2.6.1 色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(odsep,4.6 mm×250 mm, 5 μm,迪马公司);甲醇水(体积比95:5)为流动相;检测波长为249 nm[5];柱温30 ℃。理论塔板数按次黄嘌呤峰 计算 ，不低于3 800，在此条件下测得次黄嘌呤、肌苷与相邻组分分离度良好。分别精密吸取次黄嘌呤对照品溶液、肌苷对照品溶液与供试品溶液各10 μl，分别进样，记录色谱图，见图1
2.6.2 对照品储备溶液的制备 分别精密称取次黄嘌呤对照品和肌苷对照品适量，加流动相配制成1 μg·ml-1 的次黄嘌呤对照品储备溶液、100 μg·ml-1的肌苷对照品储备溶液。
2.6.3 供试品溶液的制备[5] 精密称取样品2.0 g，置具塞锥形瓶中，加水50 ml，密塞，浸泡1 h，超声30 min，残渣再加水50 ml提取1次，合并提取液，离心10 min(4 000 r·min-1)。精密量取提取液1 ml，用流动相定容至10 ml，滤过，即得。
2.7 方法学考察
2.7.1 线性关系考察 分别精密吸取次黄嘌呤对照品储备溶液0.2、0.4、1.2、1.6、2 ml置10 ml量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀;分别精密吸取肌苷对照品储备溶液0.4、0.5、0.6、1.0、1.2、1.5 ml置10 ml量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀。分别取上述溶液各10 μl，进样，按“2.6.1”项下色谱条件进行分析。以质量浓度(ρ)为横坐标,峰面积(a)为纵坐标,绘制标准曲线，得回归方程:
次黄嘌呤a =3×10-6ρ-0.0108，r=0.999 2，进样量在0.020 8～0.208 μg·ml-1范围内线性关系良好。肌苷a = 5×10-5ρ+0.2665，r=0.999 4，进样量在4.004～15.015 μg·ml-1范围内线性关系良好。
2.7.2 精密度试验 取同一对照品溶液,重复进样6次,每次10 μl,根据峰面积 计算 含量，次黄嘌呤和肌苷的rsd分别为1.53%、1.80%,结果表明本方法精密度良好。
2.7.3 稳定性试验 按“2.6.3”项下方法制得供试品溶液,按“2.6.1”项下方法于0、2、4、6、8、12 h分别进样10 μl,根据峰面积计算含量，次黄嘌呤和肌苷的rsd依次分别为1.70%、1.80%,表明溶液在12 h内稳定性良好。
2.7.4 重复性试验 按“2.6.3”项下方法分别制得供试品溶液6份,按“2.6.1”项下方法进行测定,根据峰面积计算含量,次黄嘌呤和肌苷的rsd分别为1.5%和2.6%，表明本方法重复性良好。
2.7.5 加样回收率试验 取已知含量的广地龙粉末约1g,精密称定,共9份，分别精密加入次黄嘌呤和肌苷对照品溶液(次黄嘌呤质量浓度为0.100 2 mg·ml-1，肌苷质量浓度为2.003 μg·ml-1)适量,按“2.6.3”项下方法制备,依法测定。计算得到次黄嘌呤的平均回收率为96.8%，rsd值为1.78%(n=9);肌苷的平均回收率为103.2%，rsd值为1.43%(n=9)。结果见表2。表2 次黄嘌呤和肌苷加样回收率测定结果
2.8 样品测定 取甘草水制广地龙饮片5批，按“2.6.3”项下方法制备供试品溶液，按 “2.6.1”项下条件测定样品中次黄嘌呤和肌苷的含量，结果见表3。5批样品次黄嘌呤的平均含量为0.0069%，肌苷的平均含量为0.4516%。结合不同批次药材质量存在差异进行考虑，暂定按干燥品计算，甘草水制广地龙中次黄嘌呤含量不得少于0.006%，肌苷含量不得少于0.40%。表3 甘草水制广地龙饮片中次黄嘌呤和肌苷的含量
3 讨论
肌苷在稀酸中易水解产生次黄嘌呤和d核糖，为考察炮制对次黄嘌呤和肌苷成分的影响，探讨其转化机制，故同时选用两者作为含量测定指标。在本试验色谱条件下，上述2种成分可得到有效分离。经方法学考察，本方法的重复性、稳定性、精密度、加样回收率试验均符合有关规定，为广地龙质量标准化提供了依据。
建议甘草水制广地龙饮片的质量标准为：水分含量≤5.0%，总灰分含量≤10.0%，酸不溶性灰分含量≤5.0%，水溶性浸出物浓度≥20.0%，乙醇浸提物浓度≥8.0%,次黄嘌呤含量≥0.006%，肌苷含量≥0.40%。
【 参考 文献 】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版一部[m].北京:化学 工业 出版社,2005:80-81; 附录ⅸh, ⅸk,ⅹa.
[2] 龙艳华.地龙的化学及药理研究概况[j].数理医药学杂志,2005,18(4):379-381.
[3] 王筠默.中药研究与临床应用[m].上海:上海中医药大学出版社,2006:245.
[4] 黄若干,宾祖焕,梁峰,等.hplc法测定肌苷口服溶液中的有关物质[j].
