作者：王治伟，马文丽，夏巍，杨琼，郑文岭
【摘要】 目的 利用自杂交的方法对芯片杂交样品的标记效率进行检测和实验质控。方法 提取人红白血病k562细胞rna后，将核酸样品等分成两等份，分别应用通用引物标记cy3和cy5荧光物质，然后和制备的k562芯片进行杂交，通过比较杂交后探针上cy3和cy5的荧光信号强度，对样品的标记效率和杂交流程进行实验分析和质控。结果 杂交后的芯片探针显示为等量的cy3和cy5重叠后的黄色荧光，由于样品是等量的同一种核酸物质，从而证明了样品标记的效率一致性较好。结论 通过自身杂交方法来比较相同样品两种荧光标记物的信号强度，对芯片本身的质量进行检测，分析标记物的标记效率，可以应用于生物芯片实验的质量控制。
【关键词】 生物芯片;标记;杂交
abstract:objective to investigate the effect of selfhybridization method of analyzing samples labeling for microarray experiment. methods the total rnas were extracted and purified from k562 cells to synthesize doublestranded cdnas by reverse transcription. then two homologous samples were labeled with two different fluorescent dyes cy3 and cy5. and the labeled samples were examined with the printed microarray. results with the same quantity of fluorescence cy3 and cy5 overlap, the microarray image showed almost yellow color. and the selfhybridization method could be used to control the fluorescence quality. conclusion the method that used selfhybridization method to obtain quality data set from a microarray experiment for assessment of the microarray and labeled samples quality can be used in quality control of microarray experiment.
key words:microarray; label; hybridization
生物芯片实验是一个多阶段的实验流程，包括了从芯片的打印制备、样品的分离提取、荧光物质的标记、芯片的杂交和扫描等［1］。wwW.11665.com在实验中常常由于标记效率的差异影响实验结果，特别是表达谱芯片中两种样品的竞争性杂交，标记效率的不同会直接影响差异表达基因的分析。目前对于芯片的样品标记，结合统计学提出了很多实验后数据分析方法，但是从整体实验设计对样品标记效率直接分析，来对实验过程进行质量控制，还未见报道［2，3］。本研究采用自身杂交的方法，将同样的实验样品分别用不同荧光物质标记后和芯片进行杂交，通过比较两种荧光物质的信号强度，对样品的标记效率进行评估和研究，从而为进一步应用基因芯片技术提供更好的途径。
1 材料与方法
1．1 材料
人红白血病k562细胞株由广州军区总 医院 医学实验科提供；总rna提取试剂（trizol）及pcr产物纯化试剂盒购自上海博彩生物工程公司；mrna纯化试剂、荧光染料cy3、cy5 dutp购自pharmacia公司；限制性内切酶sau3aⅰ、taq酶、t4dna连接酶、rnase h等购自takara生物技术公司；cmtgaps表面氨基化玻片购自corning公司；dmso及formamide购自amresco公司。
1．2 细胞培养
k562细胞常规培养（37 ℃，5% co2）于含10%（φ）的精制小牛血清和青霉素、链霉素各100 u/ml的rpmi1640培养基中。
1.3 靶基因片段的制备
应用rdpcr技术构建k562细胞正常状态下的cdna片段文库［4］，从中选择克隆扩增。pcr产物经纯化后，紫外分光光度计du530测定浓度，用dmso调整浓度为0.5 mg/ml，加样至384孔板中备用。
1.4 芯片的制备
一种用于生物芯片标记效率的研究方法用cartesian pixsys 5500 基因芯片打印仪和 cmtgaps 玻片进行点样，然后在biorad 紫外交联仪下以150 mj的总能量进行交联固定，80 ℃干烤2 h后备用。
1.5 杂交样品的制备
1.5.1 细胞总rna的提取
具体实验步骤参照试剂盒说明，分别提取2次培养细胞的总rna。
1.5.2 mrna的纯化
mrna纯化采用pharmacia mrna纯化试剂盒。取40 μg rna加入1 ml的elution buffer悬浮,oligo（dt）cellulose沉淀，室温混匀10 min以上，16 000 r/min离心10 s，弃上清液。先用high salt buffer洗涤沉淀5次，再用low salt buffer洗涤3次。用0.3 ml low salt buffer重悬,oligo（dt）cellulose沉淀，转移到离心柱中，16 000 r/min离心10 s，洗2次。用0.2 ml 65 ℃预热的elution buffer洗脱2次，收集2次流出液，du530紫外分光光度仪进行定量。
1.5.3 cy3、cy5标记通用引物限制性扩增
将纯化的mrna 逆转录生成cdna 第一链后，继以rnase h切割杂化双链中的mrna，并作为合成cdna第二链的引物延伸成双链cdna，用sau3aⅰ酶切，酶切片段加接头［sip（5′pgatcm cacacc agccaaaccca 3′）和sir（5′ggtttggctggtgtg 3′）逐渐降温退火合成通用接头。取等同两份样品，加入25 μl 2×pcr 缓冲液、5 μl dntp、1 μl模板，2 μl cy3以及cy5荧光标记的通用引物（gtttggctggtgtggatcu），加ddh2o至体积为49 μl，最后加入1 μl taq dna聚合酶。95 ℃变性5 min后，进行rdpcr扩增，18个循环（95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s），最后72 ℃延伸7 min。取加接头的酶切片段1 μl做模板，使用不标记荧光通用引物2 μl，25 μl 10×pcr 缓冲液，5 μl dntp（各2 mmol/l），1.5 μl cy5dutp(1 mmol/l)，加ddh2o至体积为49 μl，最后加入1 μl taq dna聚合酶，pcr反应条件同上。
1.6 杂交及检测
打印好的芯片uitragapstm片基置于含有预杂交液（25%甲酰胺，5×ssc，0.1%sds，0.5%bsa）42 ℃水浴5 min，取15 μl标记样品干燥离心，再用5 μl ddh2o溶解，95℃ 5 min，冷却1 min，加10 μl杂交缓冲液（50%甲酰胺，10×ssc，0.2%sds）。吸取3 μl 滴加到芯片阵列表面，置于corning封闭杂交盒中42 ℃水浴16 h。杂交后芯片转移到清洗液中（0.1×ssc，0.1%sds）室温下清洗10 min，0.1×ssc清洗5 min，用100%酒精脱水干燥。用gsi lumonics公司的scanarray lite进行扫描。
2 结 果
2.1 rna质量控制结果
使用agilent 2100生物分析仪鉴定样品的rna质量，分别鉴定28 s/18 s峰值的面积比值、a260/a280的ratio值、质量和浓度，从电泳得到的结果可以看出，抽提的总rna没有发生明显的降解（如图1）。
2.2 芯片杂交结果
样品分成等同两份，分别标记cy3和cy5后与芯片进行杂交，从杂交结果来看（图2），芯片周边以及内部的探针信号清晰，强度和亮度都符合实验要求，并且背景信号比较小，信噪比较好；在杂交时两种相同基因片段，标记不同的荧光物质和探针发生竞争性杂交时，得到的探针信号是红绿两种荧光，因此实验得到的芯片结果符合实验的要求。
2.3 芯片探针的红绿两种荧光的信号散点图
在软件分析后，得到芯片杂交的散点图（图3），y轴代表cy3的杂交信号强度，x轴代表cy5的杂交信号强度，探针信号强度分布在斜率为1的45°角直线附近，也说明两种荧光标记后在和芯片探针进行杂交时信号强度一致。
3 讨 论
生物芯片技术已经成为生命 科学 领域中一个重要的研究工具，由于它可以同时检测数以万计基因的丰度水平，可以从分子层面来了解相关基因的生物学功能。然而由于其实验过程容易受到芯片制备、样品标记和杂交等各因素的影响，因此需要建立芯片的质控方法来消除由于外加或操作因素产生的误差［5，6］。而目前主要集中在对于芯片杂交后得到的数据的统计学分析与处理上，针对芯片杂交本身，特别是从实验设计角度来对芯片的质量进行控制的研究报道较少。
本实验应用自身杂交的方法，采用本科室已经构建的cdna文库，进行芯片的打印，同时对提取的rna样品进行荧光物质的标记，而在标记时将样品分成相同的两等份，分别标记cy3和cy5两种不同的荧光染料，然后将标记好的样品同时和芯片进行杂交。杂交的过程，因为是相同的样品，并且假设标记效率和杂交时与探针发生互补配对的几率相同的话，在芯片上的探针应该结合相同丰度的cy3和cy5标记的样品，而cy3荧光物质在芯片扫描图上显示为绿色，cy5显示为红色，但两种荧光物质的颜色等份叠加后，就显示为黄色。因此，如果芯片得到的结果中，探针的点为均匀性的黄色，证明了样品的两种荧光物质标记效率是一致的，同时也在一定程度上对芯片在制作和杂交过程中的质量进行控制。
而如果得到的实验结果不是理想中的黄色，而是偏红色或者偏绿色的杂交结果，主要有2个问题：一是标记时的效率导致相同等份的样品得到了不同等份的标记样品，二是由于在进行芯片扫描时由于对两种荧光物质的分辨率不同所导致［7］。对后面的问题检测相对简单，可以用芯片扫描仪所配备的标准片进行测试，就可以知道哪一种荧光物质存在放大效应。而对标记效率不同所导致的样品偏差，需要进行标记后的样品检测，根据质量浓度比来对进行杂交时所用的样品进行量的调整，从而保证在芯片杂交时两种荧光物质相同［8］。同时对于单色荧光标记的芯片，诸如检测芯片等，就可以根据标记效率的误差，对整体荧光信号强度进行加权校正后再进行数据的分析，从而得到更为科学的实验结果。
本实验从实验设计上采用了等份样品不同标记同时杂交的方法，通过检测杂交后的芯片扫描结果，来对芯片的本身质量进行控制同时，也检测样品不同荧光物质标记效率是否存在偏差，进而对单个芯片的实验流程进行监测，来对目前由于不同种类芯片以及不同型号扫描仪进行实验时所采用的质量控制方法提出更方便和广泛适用的实验思路，为芯片技术进一步在生命科学领域得到应用提供实验依据。
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