作者：杨静,谭沛,潘桂湘,代志,郭锦明
【摘要】 目的 建立同时测定壮骨关节丸中淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素含量的hplc方法。方法 采用zorbax sbc18 (4.6 mm×150 mm, 5 μm)色谱柱；流动相：乙腈0.05%甲酸水溶液（梯度洗脱）；检测波长：0→8 min为270 nm，8→15 min为246 nm；流速：1.0 ml/min；柱温为35 ℃。结果 淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素分别在0.0223～0.713 μg（r=0.9997）、0.0272～0.869 μg （r=0.9998）、0.0213～0.681 μg（r=0.9998）范围内与峰面积呈良好的线性关系；平均回收率分别为101.1% (rsd=3.27%)、97.66%(rsd=2.46%)、99.65%(rsd=2.13%)。结论 该方法简便可行、重现性好、可作为壮骨关节丸的质量控制方法。
【关键词】 壮骨关节丸；淫羊藿苷；补骨脂素；异补骨脂素;梯度洗脱
abstract:objective to establish an hplc-vwd method for simultaneous quantification of icariin, psoralen and isopsoralen in zhuangguguanjie pills by using switching wavelength. methods the separation was performed on a zorbax sb-c18 (4.6 mm×150 mm, 5 μm) column using the gradient elution which consisted of acetonitrile and 0.05% formic acid aqueous solution at the flow rate of 1.0 ml/min. the detection wavelength was at 270 nm in the first 8 min, while changed to 246 nm at 8-15 min. column temperature was fixed at 35 ℃. results for icariin , psoralen and isopsoralen, the linear ranges were 0.0223-0.713 μg(r=0.9997), 0.0272-0.869 μg (r=0.9998) and 0.0213-0.681 μg (r=0.9998), respectively, and their average recoveries were 101.1%(rsd=3.27%), 97.66%(rsd=2.46%) and 99.65%(rsd=2.13%), respectively. conclusion the method could be used for the quality control of zhuangguguanjie pills, which was available with a good reproducibility.
key words:zhuangguguanjie pills；switching wavelength；icariin；psoralen； isopsoralen
壮骨关节丸是由淫羊藿、补骨脂、狗脊、独活等十二味中药组成的复方制剂，具有补益肝肾、养血活血、舒筋活络、理气止痛之功效，用于肝肾不足、血瘀气滞、经络痹阻所致的骨性关节炎、腰肌劳损，症见关节肿胀、疼痛、麻木、活动受限等疾病［1］。www.11665.COm淫羊藿、补骨脂均具有补肝肾、强筋骨、祛风湿的功效，是壮骨关节丸发挥药效的重要物质基础。淫羊藿苷为淫羊藿的主要有效成分，能够显著促进人成骨细胞的增殖和分化,且使bmp2mrna的表达升高［2］；补骨脂素和异补骨脂素为补骨脂的主要有效成分［3，4］，能提高大鼠成骨细胞内碱性磷酸酶的活性，促进成骨细胞的增殖与分化［5］。已有 文献 报道对壮骨关节丸中的淫羊藿苷［6］、补骨脂素和异补骨脂素［7］分别进行了质量控制，但仅控制一种成分不能较全面地反映产品的质量。为了更好地控制该药品的内在质量, 保证临床用药的安全、有效，本研究选择淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素作为壮骨关节丸的质量控制指标，采用紫外波长切换的方法同时对3个成分进行了测定。
1 仪器与试药
1.1 仪器
waters 2695高效液相色谱仪（四单元数码梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、vwd检测器）；mettler toledo ax205（瑞士）十万分之一天平；bp121s万分之一天平（德国塞多利斯公司）；kq250e型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，频率40 khz，功率250 w）。
1.2 试药
淫羊藿苷（110737200312）、补骨脂素（110739200512）和异补骨脂素（110738200511）均购于 中国 药品生物制品检定所；壮骨关节丸由深圳三九医药股份有限公司提供（批号：0707041、0707241、0708151、0708171、0708181）；缺补骨脂和淫羊藿的阴性制剂为实验室自制（按处方比例）。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱： agilent zorbax sbc18 (4.6 mm×150 mm, 5 μm)； 流动相：a为乙腈，b为0.05%甲酸水溶液，梯度洗脱 （0 min, 30% a; 10 min, 34% a; 15 min, 65% a）； 检测波长： 0→8 min为270 nm， 8→15 min为246 nm；流速为1.0 ml/min；柱温为35 ℃；进样量：10 μl。在此色谱条件下各成分分离良好，缺补骨脂和淫羊藿的阴性制剂对化合物的测定无干扰。对照品及供试品溶液色谱图见图1。
2.2 对照品贮备液的制备
精密称取淫羊藿苷7.13 mg、补骨脂素8.69 mg、异补骨脂素6.81 mg，置同一10 ml量瓶中，加入8 ml甲醇超声溶解并定容至刻度，混匀，得混合对照品贮备液。
2.3 供试品溶液的制备
取壮骨关节丸，研细，取约1.5 g，精密称定，置25 ml容量瓶中，加甲醇25 ml，超声提取20 min，放至室温，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
2.4 阴性供试品溶液的制备
取缺补骨脂、淫羊藿的阴性样品，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备缺补骨脂、淫羊藿的阴性供试品溶液。
2.5 线性关系考察
精密移取混合对照品贮备液1.0 ml至10 ml量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀。采用逐级稀释法配制淫羊藿苷质量浓度为2.228、4.456、8.913、17.83、36.65、71.30 μg/ml；补骨脂素质量浓度为2.716、5.431、10.86、21.73、43.45、86.90 μg/ml；异补骨脂素质量浓度为2.128、4.256、8.513、17.03、34.05、68.10 μg/ml的系列混合对照品溶液。在“2.1”项的色谱条件下进样10 μl，测定峰面积。以各对照品浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）作线性回归，结果见表1。表1 淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素的回归方程及线性范围（略）
2.6 精密度试验
取同一混合对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积。淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素峰rsd分别为0.38%、0.40%、0.41%，结果表明仪器的精密度良好。
2.7 稳定性试验
取同一供试品溶液分别于0、2、4、6、8、10、12 h 进样10 μl，测定峰面积。淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素峰rsd分别为0.18%、0.29%、 0.31%,表明供试品溶液在12 h 内基本稳定。
2.8 重现性试验
取同一批号壮骨关节丸粉末（0707241），精密称定6份，按“2.3”项制备供试品溶液，依法测定， 计算 含量。淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素含量分别为0.1863 mg/g（rsd=3.32%）、0.2903 mg/g（rsd=2.35%）和0.2293 mg/g（rsd=2.24%），结果表明方法的重复性良好。
2.9 回收率试验
取同一批号壮骨关节丸粉末（0707241），取约0.8 g，精密称定6份，分别置25 ml量瓶中，精密加入0.221 mg/ml淫羊藿苷对照品溶液0.7 ml，0.325 mg/ml补骨脂素对照品溶液0.7 ml，0.438 mg/ml异补骨脂素对照品溶液0.4 ml，按“2.3”项制备供试品溶液，依法测定，计算回收率。淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素平均回收率分别为101.1% (rsd=3.27%)、97.66%(rsd=2.46%)、99.65% (rsd=2.13%)，结果见表2。表2 加样回收率测定结果（略）
3.10 样品的测定
取不同批号的壮骨关节丸，研细，取约1.5 g，按“2.3”项制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件下测定，每批号平行操作两份。以外标法计算壮骨关节丸中各成分的含量，结果见表3。表3 壮骨关节丸含量测定结果 （略）
3 讨 论
3.1 检测波长的确定
补骨脂素和异补骨脂素的最大吸收波长为246 nm，淫羊藿苷的最大吸收波长为270 nm。为了达到检测灵敏度高、干扰小的目的，利用可变波长紫外检测器，建立了波长切换高效液相色谱法使不同化合物在各自最大吸收波长下测定，以获得最佳的检测结果。
3.2 供试品制备方法的确定
试验中对影响样品提取效率的主要因素：提取溶剂浓度(50%甲醇、75%甲醇、甲醇)、提取时间（10 、20、30 min）和提取溶剂的用量(25、50、100 ml)，进行了单因素考察。结果表明：甲醇25 ml超声提取20 min的提取效果较好，故本试验采用25 ml甲醇作为提取溶剂，超声提取20 min。
【 参考 文献 】
［1］国家药典委员会. 中华人民共和国2005版药典一部［m］．化学 工业 出版社,2005:444.
［2］殷晓雪,陈仲强,党耕町,等.淫羊藿苷对人成骨细胞增殖与分化的影响［j］.
