作者：李建宁，何岚，叶枫，董春萍，王毅
【摘要】 目的： 研究 解偶联蛋白2（ucp2）基因启动子区-866g/a的多态性在 中国 北方汉族正常人群及糖尿病人群的分布，了解其与2型糖尿病（t2dm）及β细胞功能关系. 方法 ： 采用pcr及pcrrflp 方法检测101名正常人及192名t2dm患者的ucp2基因启动子区-866g/a的多态性，对t2dm患者进行葡萄糖耐量试验， 计算 β细胞功能指数及胰岛素敏感指数. 结果： ① -866g/a基因型频率在中国北方汉族正常人群及t2dm人群中的分布分别为：gg31例(30.7%),ga46例(45.5%),aa24例(23.8%)及gg44例(28.1%),ga103例(49.6%),aa45例(22.3%)，统计 分析 无显著性差异. ② -866g/a多态性的含a等位基因型与胰腺β细胞的胰岛素分泌功能指数δi30/δg30，homaβ，mbci及ins30呈负相关. 与胰岛素敏感指数iai无关. 结论： ① 中国北方汉族人群的ucp2基因启动子区-866g/a基因型分布与日本人相似，与欧洲白人及高加索人群存在显著性差异. ② ucp2基因启动子区-866g/a基因型在两组人群的分布无差异. ③ ucp2基因启动子区-866g/a多态性与胰腺β细胞的胰岛素分泌功能相密切相关.
【关键词】 解偶联蛋白2；2型糖尿病；基因多态性
0引言
β细胞功能减低和胰岛素抵抗是2型糖尿病（t2dm）发病的主要因子，其发生不仅受复杂的环境因素 影响 ，而且受遗传因素影响，被认为是一类多基因遗传性疾病. 近年的研究显示解偶联蛋白2（ucp2）参与了能量代谢atp的解偶联，其启动子区-866g/a多态性影响了胰腺β细胞功能，为糖尿病发生危险性的预测因子. 我们对中国北方汉族人群中ucp2 基因启动子区-866g/a多态性与t2dm及胰腺β细胞分泌功能的相关性进行研究.
1对象和方法
1.1对象糖尿病组（dm）：192名t2dm患者来自200503/200512西安 交通 大学第一附属 医院 内分泌科门诊及病房，诊断标准 参考 1999年世界卫生组织（who）的糖尿病诊断标准：空腹血浆葡萄糖水平（fpg）≥7.0 mmol/l和/或75 g葡萄糖耐量试验（ogtt试验）服糖后2 h血浆葡萄糖水平（pg2h）≥11.1 mmol/l. 所有患者年龄≥35岁，有严重心、脑、肝、肾功能损害及影响糖代谢的其他内分泌疾病者被排除在外. 非糖尿病组（ndm）：101名非糖尿病患者来自西安交通大学第一附属医院体检中心，年龄≥35岁，fpg<6.1 mmol/l并且pg2h<7.8 mmol/l，除外严重心、脑、肝、肾功能损害及糖尿病家族史者.
1.2方法
1.2.1一般观察指标记录两组患者的姓名、性别、年龄、发病年龄、病程、收缩压（sp）,舒张压（dp），并测定空腹总胆固醇（chol）,三酰甘油（tg）,高密度脂蛋白（hdl）及低密度脂蛋白（ldl）,并计算体质量指数（bmi）.
1.2.2ogtt试验t2dm患者于夜间禁食8～10 h，于第2日清晨空腹服用75g葡萄糖，分别于0，30，60，120，180 min取静脉血，测定空腹血糖(fpg), 30 min血糖（pg30）, 60 min血糖(pg1h), 120 min血糖（pg2h）, 180 min血糖（pg3h）及空腹胰岛素(fins), 30 min胰岛素（ins30）, 60 min胰岛素（ins1h）, 120 min胰岛素（ins2h）, 180 min胰岛素（ins3h）.
1.2.3胰岛素敏感性及分泌功能指标［1-3］胰岛素分泌指数(homaβ)= 20×fins/(fpg3.5)，胰岛素分泌指数(δins30/δpg30)=(ins30fins)/(pg30fpg)，新β细胞功能指数（mbci）=(fpg×fins)/(pg2h+pg1h7.0)，空腹血糖胰岛素乘积的倒数（iai=1/(fpg×fins).
1.2.4ucp2基因启动子区-866g/a多态性的pcrrlfp分析采用离心柱型血液基因组dna提取试剂盒（北京天为 时代 科技 有限公司）提取人基因组. 上游引物：5′cacgctgcttctgccaggac3′，下游引物：5′aggcgtcaggagatggaccg3′（ 北京奥科生物技术有限责任公司），pcr反应条件［4］：首先在95℃变性8 min，然后95℃变性1 min，65℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸7 min. 使用2×taq plus pcr mastermix（北京天为时代科技有限公司）进行pcr. 取pcr产物10 μl加入10 u的mlu1限制性内切酶37℃水浴过夜，消化片段用25 g/l琼脂糖电泳分离，eb显色，在紫外灯下观察并记录结果. g等位基因者被mlu1切为两段（291 bp和70 bp）,而a等位基因则不被切开（361 bp，图1）.
统计学处理： 以hardyweinberg 平衡检验确认研究样本的群体代表性,分类变量比较使用χ2检验，连续变量以x±s表示，与基因型的关系使用方差分析（oneway anova）检验，使用logistic regression 进行连续变量与基因型的多因素分析（对性别、年龄、病程、发病年龄进行校正）. p<0.05认为有显著性差异，所有数据使用spss 11.5统计软件进行分析.
图1ucp2 -866g/a基因多态性的 pcrrlfp结果
2结果
2.1一般资料的hardyweinberg 平衡检验两组的hardyweinberg平衡检验p值均>0.05，表明两组的研究样本的群体代表性好. 两组在性别方面存在差异，因性别不影响基因型的表达，故对试验无影响. dm组的bmi，fpg，chol及tg比ndm组高，有统计学意义，而年龄、血压及hdl无差别（表1）. 表1糖尿病组与非糖尿病组的一般临床资料比较
2.2ucp2启动子区-866g/a基因型频率在不同种族人群中的比较-866g/a的基因型频率在各种族间有明显差异. 两两比较显示中日之间无差异（p=0.480，表2），高加索人与欧洲白人之间无差异（p=0.345），中国人与高加索人、欧洲白人之间有显著性差异（p=0.000）. 表2不同种族ucp2启动子区-866g/a基因型频率的比较
2.3dm组与ndm组ucp2启动子区-866g/a基因型频率的比较-866g/a基因型在dm人群与ndm人群的分布无差异（表3）. 表3dm组与ndm组-866g/a基因型频率的比较
2.4dm组ucp2启动子区-866g/a的不同基因型一般资料比较-866g/a的三种基因型在年龄、bmi、发病年龄、病程、血脂方面无差异（表4）.表4dm组-866g/a的不同基因型一般资料比较
2.5dm组ucp2启动子区-866g/a不同基因型胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能比较-866g/a的三种基因型在pg2h，ins30有显著性差异，aa型较gg型有更高的pg2h，更低的ins30，并且胰岛β细胞分泌胰岛素功能指标δi30/δg30，homaβ，mbci明显减低. 胰岛素敏感性指标iai无差异（表5）. 多重比较显示：pg2h，ins30，δi30/δg30，homaβ，mbci等指标在gg型与ga，aa型之间有显著性差异，而在ga型与aa型之间无差异（表6）.
2.6logistic regression 分析 由于单因素分析ga型与aa型无显著性差异，将ga型与aa型合并为含a基因型，采用logistic regression 校正年龄、bmi、发病年龄、病程以后，gg型与含a基因型（ga+aa）在pg2h，ins30，δi30/δg30，homaβ，mbci这些指标上仍存在显著性差异. 表5dm组-866g/a的不同基因型胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能的比较表6dm组三种基因型胰岛β细胞功能的多重比较
3讨论
ucp 作为线粒体内膜的质子载体，能将线粒体内膜外侧的h+运回内膜内侧，降低膜两侧的电化学梯度，使氧化过程与adp磷酸化过程解偶联，atp 生成减少,而以产热的形式释放能量，在能量的代谢中具有重要的作用.
ucp2组织分布广泛，其在脂肪组织中的过低表达，将会引起肥胖. krempler f等［7］报告ucp2-866g/g型等位基因者的ucp2基因在脂肪组织中呈现低表达，是中年高加索人肥胖的危险因素. 而sasahara m等［5］在日本人群的实验未发现ucp2 -866g/a多态性与肥胖的关系，但是其gg型明显少于高加索人，aa型明显多于高加索人. 我们的实验结果与日本人的相似，由于汉族人与日本人的bmi相似，与欧洲人差异明显，推测肥胖除与环境因素有关外，ucp2基因可能在其中发挥了一定的作用.
krempler等［7］发现，gg型糖尿病患病率明显减少. dadamo等［6］发现，aa型的女性患者的糖尿病患病率明显增加，在男性中无统计学差异. 而在日本人群中未发现糖尿病患病率的改变. 我们的实验结果与日本人 研究 相似，与欧洲人不一样. 这种差异可能与样本的选择有关（因 中国 人与日本人的体质量指数比欧洲人明显减少），也可能与遗传背景的差异有关.
ucp2存在于胰腺β细胞中，可通过 影响 atp合成而影响β细胞的胰岛素分泌功能. chan 等［8］发现在细胞培养时，ucp2 mrna的高表达导致β细胞胰岛素分泌减少. zhang 等［9］发现ucp2 基因剔除小鼠患有高胰岛素血症. 将-866g和-866a转染进入paz脂肪细胞及胰腺β细胞，-866a展现出较高的转录活性，ucp2的表达量明显增高［5,7,10］，提示a等位基因可能通过增加ucp2的表达量减少胰腺β细胞atp合成而影响胰岛素的分泌功能. 我们的实验发现，gg型与ga型、aa型相比较δi30/δg30, homaβ, mbci及ins30明显增高，而fins, ins2h, ins3h及胰岛素敏感指数iai则无差别. 而g/a型与a/a型相比较则无上述的差异，表明含a基因型的个体的β细胞功能受损. 由于g/a型与a/a型相比较无显著性差异，因此将其合并为含a基因型，与gg型进行logistic回归分析，显示含a基因型是独立于年龄、bmi、发病年龄及病程的胰岛素分泌功能下降的危险因素. sasahara等［5］通过静脉注射25g葡萄糖， 计算 胰岛素分泌功能△iri4在含a基因型人群中明显下降，而胰岛素敏感指数si及sg无差异. sesti等［10］在igt人群中发现早期胰岛素分泌功能指数i30/i0 在aa型明显下降，而胰岛素敏感指数无显著性差异. 这些研究结果与本实验结果相似.
综上所述，我们的研究显示： ① 中国北方汉族人群的ucp2-866g/a基因型分布与日本人相似，与欧洲白人及高加索人群存在显著性差异. ② ucp2－866g/a基因型在dm人群与ndm人群的分布无差异. ③ dm人群中含a基因型的胰岛β细胞分泌功能显著低于gg型，说明含a基因型可能是dm发生的危险预测因子.
致谢： 本实验得到了楚庸烈教授的精心指导，分子生物学实验部分在西安 交通 大学医学院微生物分子生物实验室完成.
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