【摘要】 目的：研究携带编码人天然颗粒溶素（gls）和小鼠il12基因质粒（pzm03）偶联重组耻垢分枝杆菌（atcc607）经鼻黏膜免疫小鼠后，小鼠体内的免疫状况。方法：balb/c小鼠36只，随机分为生理盐水、pzm03、atcc607、卡介苗（bcg）、重组atcc607（即携带pzm03的atcc607）、灭活重组atcc607组；采用滴鼻法免疫小鼠，bcg组0、14天各1次，其它组0、4、14天各1次，第0天免疫后4周处死小鼠，用elisa检测血清中ifnγ、il12、igg2a、ll4的分泌水平和淋巴细胞ppd诱导的ifnγ分泌水平以及肺泡灌洗液特异性siga的水平，用mts法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况。结果：重组atcc607血清中ifnγ、il12水平与bcg组无明显差异但明显高于其他组（p<0.05），igg2a水平重组atcc607组高于bcg组和其他组（p<0.05），各组间il4水平差异无统计学意义。重组atcc607、bcg、灭活重组atcc607及atcc607组用ppd均可诱导小鼠脾淋巴细胞增殖，各组间差异无显著意义，但与生理盐水和pzm03组间差异有显著意义（p<0.05）。重组atcc607组ppd诱导淋巴细胞ifnγ明显高于其它组（p<0.05），与bcg组比较无显著差异。重组atcc607等含菌组经鼻黏膜免疫可产生黏膜特异性siga。结论：重组atcc607经鼻黏膜免疫小鼠后，机体特异性免疫特别是细胞免疫和黏膜免疫增强，为重组atcc607治疗结核病的研究奠定了基础。www.11665.com
【关键词】 耻垢分枝杆菌 gls il12 细胞免疫 鼻黏膜免疫
the effect of immunization by recombinant mycobacterium smegmatis encoding gls and il12 in mice
yang chun, li na, yi zhengjun, he yonglin, li junming, zhu daoyin.
department of microbiology, chongqing university of medical sciences, chongqing 400016, china
［abstract］ objective:to study the immune effect of recombinant mycobacterium smegmatis（atcc607） carrying the plasmid encoding human granulysin（gls） and murine il12 by intranasal immunization in mice.methods:balb/c mice were intranasally immunized with normal saline, pzm03,atcc607,bacille calmetteguerin（bcg）,recombinant atcc607 and inactivation recombinant atcc607 respectively. the mice were sacrificed 4 weeks after the first immunization. the levels of il12, ifnγ, igg2a, ll4 in serum, siga in balf（bronchoalveolar lavage fluid） and ifnγ released from spleen lymphocytes stimulated with ppd were detected with elisa. the proliferation of spleen lymphocytes stimulated with ppd were detected with mts.results:the levels of il12, ifnγ in serum in recombinant atcc607 group and bcg group were higher than that of other groups（p<0.05），the difference between recombinant atcc607 group and bcg group was not significant . the levels of igg2a in recombinant atcc607 group and bcg group were higher than that of other groups（p<0.05），especially in recombinant atcc607 group（p<0.05）. no change of il4 was found in all groups. the proliferation of spleen lymphocytes stimulated with ppd in atcc607 group，bcg group，recombinant atcc607 group and inactivated recombinant atcc607 group was higher than the normal saline group and pzm03 group（p<0.05）. ifnγ released from spleen lymphocytes stimulated with ppd in recombinant atcc607 group and bcg group was higher than that of other groups（p<0.05），the difference between recombinant atcc607 group and bcg group was not significant. the specific siga in balf was detected in all groups made of bactera.conclusion:the specific immunity，especially cell mediated immunity and mucosal immunity have been enhanced after intranasal immunization with recombinant atcc607. the results establish the foundation for the therapy against tuberculosis with recombinant mycobacterium smegmatis.
［key words］ mycobacterium smegmatis；granulysin；il12；cellular immunity；intranasal immunization
耻垢分枝杆菌属于分枝杆菌属中的快速生长菌，属于人体正常菌群，具有与结核分枝杆菌相同菌体抗原成分，在一般情况下不致病。近年来结核分枝杆菌引起的结核病的流行趋势日趋严重，特别是多药耐药株的扩散以及hiv感染者的增多，导致结核病的发病率和死亡率大幅度上升。在对人及鼠结核病免疫发病机制的研究中发现，th1型免疫应答在抗结核分枝杆菌感染过程中有重要保护作用［1］。本研究用我室构建携带编码人天然颗粒溶素（granulysin，gls）和小鼠il12基因的真核共表达质粒pzm03，电转到分枝杆菌属的耻垢分枝杆菌，滴鼻入小鼠体内，观察重组菌对小鼠免疫效果，为重组耻垢分枝杆菌对结核病的免疫治疗打下实验基础。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌株和试剂 携带人gls基因和小鼠il12基因的质粒pzm03由本实验室构建［2］；耻垢分枝杆菌atcc607及bcg由本实验室保存；质粒dna小量抽提试剂盒、pcr产物及凝胶回收试剂盒均购自上海华舜公司；小鼠il12和il4细胞因子酶联免疫吸附试验（elisa）试剂盒购自ebioscience公司；小鼠ifnγelisa试剂盒购自晶美生物公司；羊抗鼠igg2a购自southernbiotech公司；羊抗鼠siga及亲和素标记的hrp购自kpl公司；ppd标准品购自北京药品生物制品检定所；rpmi1640购自gibco公司；小牛血清为杭州四季青公司产品；mts试剂购自promega公司。
1.2 实验动物及免疫方式 6～8周龄，雌性spf级balb/c小鼠36只，体重18～22 g，随机分为6组，即生理盐水、pzm03、atcc607、卡介苗（bcg）、重组atcc607（即携带pzm03atcc607）、灭活重组atcc607组，每组6只。用atcc607、重组atcc607及灭活重组atcc607 1×105 cfu/50 μl分别滴鼻小鼠3次（分别0、4、14天），bcg 1×105 cfu/50 μl滴鼻小鼠2次（分别0、14天），生理盐水和pzm03 50 μl分别滴鼻小鼠3次（分别为0、4、14天）。第0天滴鼻后4周，摘除小鼠眼球取血，引颈处死小鼠。收集血清和分离脾淋巴细胞备用。
1.3 重组耻垢分枝杆菌atcc607的构建［3］ 将对数生长期的atcc607菌株以预冷的10%甘油在4℃低温洗涤3次，取90 μl细菌加入10 μl纯化的pzm03质粒，轻轻混匀，冰浴1分钟，转入预冷的1 mm电转杯中，1 800 v、4 ms电击1次，迅速加入500 μl苏通液体培养基。37℃孵育3小时后涂布到含zeocin 40 μg/ml的苏通固体平板上，37℃孵育72小时后挑取阳性菌落增菌后抽提质粒，同时取1 ml菌液，离心弃上清，沉淀加入500 μl三蒸水，100℃热裂解8分钟，取上清2 μl或质粒抽提物1 μl为模板，分别作gls、il12和orim的pcr扩增。同时将鉴定的重组菌传代5～10代后再次以pcr法进行鉴定，以观察重组质粒的稳定性。
1.4 小鼠血清il12、ifnγ、igg2a、ll4的检测 取血清，作定量elisa测小鼠血清中il12、ifnγ、ll4的水平，操作步骤按试剂盒说明进行。特异性igg2a的检测，包被抗原为ppd，二抗为羊抗鼠igg2a，间接elisa法检测。
1.5 ppd诱导的淋巴细胞增殖实验［4］ 分离各组小鼠脾淋巴细胞，用含10%胎牛血清的rpmi1640调整细胞浓度为2×107 l-1，200 μl/孔加入96孔细胞培养板，实验孔加入5 μl ppd，对照孔不加ppd，调零孔不加淋巴细胞。37℃、5%co2孵箱中培养68小时后，每孔加入20 μl mts，继续培养4小时后终止培养，1 000 r/min离心10分钟，吸弃上清，每孔加入dmso 150 μl，振荡10分钟，测a570值，结果用刺激指数（stimulation index，si）=a实验组/a对照组表示。
1.6 ppd诱导的小鼠脾淋巴细胞ifnγ的测定 分离各组小鼠脾淋巴细胞，用含10%胎牛血清的rpmi1640调整细胞浓度为2×107 l-1，200 μl/孔加入96孔细胞培养板，每组设3个复孔，每孔5 μl ppd刺激，37℃、5%co2孵箱中培养72小时。每组3个孔的培养液混合，5 000 r/min离心5分钟，取上清-20℃冻存备检。ifnγ含量的测定用elisa。操作按试剂盒说明进行。
1.7 小鼠支气管肺泡灌洗液（balf）的制备及检测［5］ 固定摘取脾组织的小鼠，无菌操作切开气管上皮组织，暴露气管，将连接5号采血针的注射器水平插入小鼠气管中，每只用500 μl无菌生理盐水反复冲洗气管及肺泡8次，收集balf置-70℃待检。包被抗原为ppd，二抗为羊抗鼠siga，elisa间接法检测balf中特异siga抗体。
1.8 统计学分析 所有计量资料应用sas 8.1软件进行统计处理，采用单因素方差分析及snk检验（q检验），以p<0.05判断有明显差异。
2 结果
2.1 重组耻垢分枝杆菌atcc607的构建及鉴定 以重组菌裂解物或质粒抽提物为模板，作gls、il12和orim的pcr扩增，各片段与理论预计值完全相符，重组菌传代10代后再次以pcr法进行鉴定，结果不变，见图1。
2.2 小鼠血清il12、ifnγ和ll4检测水平 重组耻垢分枝杆菌和bcg组il12水平明显高于其它组（p<0.05），但二者之间差异无显著意义；atcc607和灭活重组耻垢分枝杆菌组间差异无显著意义，但高于pzm03质粒组和生理盐水对照组（p<0.05）；pzm03质粒组明显高于生理盐水对照组（p<0.05），见表1。
重组耻垢分枝杆菌和bcg组ifnγ水平明显高于其它组（p<0.05），但二者之间差异无显著意义；atcc607和灭活重组耻垢分枝杆菌组间差异无显著意义，但高于pzm03质粒和生理盐水对照组（p<0.05）；pzm03质粒和生理盐水对照组间差异无显著意义，见表1。
各组血清中il4细胞因子水平为0～10 pg/ml之间，无统计学意义。
2.3 小鼠血清igg2a的检测水平 重组耻垢分枝杆菌与bcg组间差异有显著意义（p<0.05）；atcc607、灭活重组耻垢分枝杆菌及pzm03质粒组间差异无显著意义，但与生理盐水组间差异有显著意义（p<0.05）； bcg组与atcc607、灭活重组耻垢分枝杆菌及pzm03质粒组间差异有显著意义（p<0.05），见表2。
2.4 小鼠脾淋巴细胞增殖实验 质粒组和生理盐水组小鼠脾淋巴细胞经过ppd刺激后增殖不明显，刺激指数（si）值小于1.5，其余各组可引起淋巴细胞显著的增殖反应，其si值均超过pbs组3倍以上，见表3。重组耻垢分枝杆菌、bcg、atcc607及灭活重组耻垢分枝杆菌组间差异无显著意义，但与质粒、生理盐水组间差异有显著意义（p<0.05）。
2.5 免疫小鼠ppd诱导的脾淋巴ifnγ的分泌水平 重组耻垢分枝杆菌和bcg组经ppd刺激后ifnγ分泌水平明显高于其它组（p<0.05），但二者之间差异无显著意义；atcc607和灭活重组耻垢分枝杆菌组间差异无显著意义，但高于pzm03质粒和生理盐水对照组（p<0.05）；pzm03质粒和生理盐水对照组间差异无显著意义，见表3。
图1 携带pzm03质粒的重组分枝杆菌atcc607pcr鉴定结果（略）
fig.1 amplification of recombinant m.smegmatis encoding pzm03 by pcr
note:m.dna marker dl2000;1.the pcr product of gls(267 bp);2.the pcr product of il12(1 671 bp);3.the pcr product of orim(1 914 bp);46.control.
表1 各组小鼠血清il12和ifnγ细胞因子水平比较（略）
tab.1 il12 and ifnγ level in serum of mice
note:il12：1)2) vs 3)4),p<0.05；1) vs 2)，p>0.05；3)4) vs 5),p<0.05；3) vs 4)，p>0.05；5) vs control，p<0.05. ifnγ：1)2) vs 3)4)，p<0.05；1) vs 2)，p>0.05；3)4) vs pzm03 and control，p<0.05；3) vs 4)，p>0.05；pzm03 vs control，p>0.05.
表2 各组小鼠血清特异性igg2a水平（略）
tab.2 specific igg2a level in serum of mice
note:1) vs 2)，p<0.05；2) vs 3)，p<0.05；3) vs control，p<0.05.
表3 各组小鼠ppd诱导的小鼠淋巴细胞增殖（si）和ifnγ分泌（略）
tab.3 si and ifnγ level in spleen lymphocyte cultures stimulated by ppd in immunized mice
note:si：1) vs pzm03 and control，p<0.05. ifnγ：1)2) vs 3)4)，p<0.05；1) vs 2)，p>0.05；3)4) vs pzm03 and control，p<0.05；3) vs 4)，p>0.05；pzm03 vs control，p>0.05.
表4 小鼠支气管肺泡灌洗液特异性siga的变化（略）
tab.4 specific siga level in balf of mice
note:1) vs pzm03 and control，p<0.05.
2.6 小鼠支气管肺泡灌洗液ppd特异siga的测定 各组经鼻黏膜免疫后，重组耻垢分枝杆菌组、bcg、atcc607、灭活重组耻垢分枝杆菌组均产生ppd特异siga，组间差异无显著意义，但都明显高于pzm03质粒和生理盐水对照组（p<0.05），见表4。
3 讨论
在应用新一代减毒有机体载体进行基因治疗的研究中，常用的载体是经基因改造减毒李斯特菌和沙门菌，其优点是安全、廉价、有靶向性及可确保产物的生物学活性等。实验证明，减毒细菌递送系统能够把目标质粒定向导入特定的免疫细胞，尤其是巨噬细胞，并有效诱导相应的免疫反应［6］。李华等［7］以减毒沙门氏菌为载体，靶向向巨噬细胞内递送gmcsf与绿荧光蛋白等基因的真核表达质粒，在细胞和整体水平都成功检测到了目标产物的表达。sarah等［8］将细胞因子修饰的耻垢分枝杆菌作为新的抗肿瘤免疫治疗剂在膀胱癌的治疗中取得良好的实验结果，研究还发现无论是重组耻垢分枝杆菌，还是野生型，在免疫力正常或t细胞缺陷或nk细胞缺陷的小鼠模型中都没有毒性。本研究所用重组耻垢分枝杆菌，一方面作为新型快生长分枝杆菌载体向巨噬细胞靶向递送gls/il12真核共表达质粒，另一方面因耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌有共同菌体抗原，而本身是非致病菌，可对已经感染结核杆菌的机体进行二次免疫激发，增强宿主th1型的细胞免疫应答。
gls是人类nk细胞和ctl细胞胞浆颗粒中的可溶性分子，是一种天然的抗菌肽，具有抗菌、抗病毒及抗肿瘤等多种生物活性［9，10］。同时体内gls的水平与机体的细胞免疫状态直接相关，细胞免疫功能低下时体内gls表达缺乏。ogawa等［11］认为血清gls的水平是评价机体细胞免疫功能状态的新指标。目前国内外未见报道小鼠能分泌鼠gls。我们在前期实验中已证实gls可在小鼠肺、脾组织中表达。il12是一种可以诱导t细胞向th1细胞分化的细胞因子，外源给予il12可产生th2免疫状态向th1型免疫状态的逆转。在一个已建立th2型免疫反应的感染动物中，外源给予il12仍能诱导出一个独立的与新免疫原相关的th1型免疫反应［12］。
黏膜免疫包括鼻黏膜免疫、口服免疫、生殖道免疫、直肠免疫等。研究显示，机体存在共同黏膜免疫系统，即在某一局部黏膜免疫可引起远端的其它黏膜免疫应答［13］。鼻黏膜免疫与口服免疫、生殖道免疫、直肠免疫等相比，有以下优势：因不受消化道ph低和酶分解的影响，对抗原剂量要求低；能诱导有效的呼吸道和全身免疫应答；操作简单，易接受等［14］。chen等［5］对比同等剂量（5x105cfu）的bcg皮下接种和滴鼻途径在balb/c小鼠产生的免疫和抵御h37rv攻击的保护效果，得出滴鼻途径在保护肺组织方面更有效。本实验结果显示实验组针对ppd产生特异siga明显高于对照组，证实通过滴鼻途径能产生特异性黏膜免疫。鼻黏膜免疫为结核病预防和治疗提供新的思路。
本实验结果重组耻垢分枝杆菌经鼻黏膜免疫后，既可产生针对ppd特异siga，又可引起血清中il12和ifnγ，特别是igg2a水平的增高，说明重组耻垢分枝杆菌所携带的il12和gls均能在体内表达并产生生物学活性。il12和ifnγ是促进th1细胞分化的重要细胞因子，同时ifnγ还能抑制th2细胞的增殖，ifnγ又可促进igg2a亚类的产生，后者能增强巨噬细胞对病原体的吞噬。重组耻垢分枝杆菌经ppd刺激可引起脾淋巴细胞增殖和脾淋巴细胞ifnγ的分泌。由此可见，重组耻垢分枝杆菌经鼻黏膜免疫，可使机体产生特异的黏膜抗菌免疫和全身免疫，尤其是th1型免疫应答，这些结果为结核病的基因治疗和免疫治疗奠定了基础。
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