【摘要】 目的 建立测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚含量的方法。方法 采用反相高效液相色谱法：色谱柱为ultimatetmaqc18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇水(体积比45∶55)为流动相，流速1 ml/min，柱温 30 ℃，检测波长274 nm。结果 丹皮酚的质量浓度在1.024～25.60 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好(r=0.999 0，n=5),平均回收率103.3%，rsd为1.5%。 结论 该方法准确、专属性强、重复性好，可用于测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚的含量。
【关键词】 光合细菌 六味地黄汤 丹皮酚
六味地黄汤由宋代名医钱乙首创，是中医著名的滋补肾阴传统代表方剂，由熟地、山茱萸、山药(三补)和泽泻、丹皮、茯苓(三泻)所组成[1]，主治肾阴不足证，从古到今在中医临床广为应用[2]。本实验室在前期研究中，探索性地将光合细菌引入到经典方剂六味地黄汤中，利用光合细菌自身的营养成分及其生物转化功能，达到提高药效的目的。药理实验结果表明，六味地黄汤经光合细菌代谢后，在增强免疫、抗衰老[3]和治疗肾阴虚证模型小鼠等方面的作用均优于传统的六味地黄汤[4]。本文建立测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚含量的rphplc法，为进一步有效控制其质量提供实验依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
waters高效液相色谱仪; water 2996 pda检测器;empower数据工作站;dl360a超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);re-52a旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂生产);sh-2dcⅲ循环水试真空泵(巩义市英峪义予华仪器厂);bp211d电子天平(德国sartorius)。wwW.11665.cOm
1.2 试药
丹皮酚对照品(批号110708200505，中国药品生物制品检定所);缺丹皮六味光合液、六味光合液(实验室自制);psb液(活菌数109个/ml，暨南大学水生生物研究所提供)，甲醇(色谱纯)，无水乙醇、三氯甲烷(分析纯)，自制双重蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备 取丹皮酚对照品1.3 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成质量浓度为25.60 μg/ml的对照品溶液，密封保存，备用。
2.1.2 样品溶液的制备 取一定量六味地黄汤生物制剂的样品溶液，调ph值至2，精密量取20 ml，加入20 ml无水乙醇，超声30 min，3 000 r/min离心10 min，滤过，取上清液，即得。
2.1.3 阴性对照溶液的制备 取不含有牡丹皮光合细菌代谢的缺味六味地黄汤样品溶液，按“2.1.2”项方法制得阴性对照品溶液。
2.2 色谱条件与系统适应性试验
色谱柱为ultimatetm aqc18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为甲醇水(体积比45∶55)，流速为1 ml/min，柱温为30 ℃，检测波长274 nm，进样量10 μl。取psb溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液与供试品溶液各10 μl进样，结果表明，丹皮酚色谱峰分离度良好，理论塔板数以丹皮酚计算不低于3 000，分离度大于1.5，阴性对照品无干扰，见图1。
2.3 线性关系的考察
精密吸取“2.1.1”项对照品溶液1.0、5.0、10.0、15.0、25.0 ml置25 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制得质量浓度为1.024、5.120、10.240、15.360、25.600 μg/ml的对照品溶液，分别进样10 μl，在“2.2”项色谱条件下，测定丹皮酚的峰面积。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为y=97278x-19986,r=0.999 0，表明丹皮酚质量浓度在1.024～25.60 μg/ml范围内与峰面积具有良好线性关系。
2.4 精密度试验
精密吸取同一对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样10 μl，平行测定5次，测得丹皮酚平均峰面积为635 245，rsd为1.20%。
2.5 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液10 μl，分别于配制后0、2、 4、 8、12、 24 h进样，按“2.2”项下色谱条件测定，测得样品中丹皮酚平均质量浓度为13.54 μg/ml，rsd为0.63%。表明供试品溶液在24 h内稳定。
2 .6 重复性试验
称取同一批样品6份，按“2.1.2”项制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件测定，测得样品中丹皮酚平均含量为13.55 μg/ml,rsd为0.95%，表明样品重现性良好。
2.7 加样回收率试验
取5份已知含量的供试样品25 ml，加入一定量丹皮酚对照品，按“2.2”项色谱条件进行测定，以外标法计算丹皮酚的含量并计算丹皮酚的回收率，结果平均回收率为103.31%，rsd为1.5%,结果见表1。表1 加样回收率试验结果
2.8 样品含量测定
取3批样品，按“2.1 .2”项方法制备样品溶液，分别精密吸取供试溶液和对照品溶液各10 μl，按“2.2”项色谱条件进样测定丹皮酚峰面积，采用外标一点法计算样品溶液中丹皮酚的含量，3批样品测定结果分别为13.50 μg/ml、13.40 μg/ml、13.40 μg/ml，平均含量为13.43 μg/ml。
3 讨 论
3.1 试验中曾试用过三氯甲烷和无水乙醇作为提取丹皮酚的溶剂进行超声萃取，结果表明，三氯甲烷提取的回收率仅为40%，明显低于乙醇提取的回收率(105.0%)，故以乙醇作为光合细菌代谢六味地黄的丹皮酚的提取溶剂。
3.2 本方法具有分离效果好、准确性高等优点，可用于六味地黄汤生物制剂中的丹皮酚含量测定。
【参考文献】
[1] 武华，吴强东.六味地黄汤的研究进展[j].新疆中医药,2003,21(5): 64-66.
[2] 吴春芝，谷福根，刘红在.六味地黄丸(汤)的临床应用进展[j].中国医院用药评价与分析，2005，5(3)：189-192.
[3] 臧建伟.六味地黄汤生物制剂的抗衰老作用研究[j].中草药，2007，38(1)：99-100.
[4] 陈艳芬，陶曙红.六味地黄汤生物制剂对阴虚动物的药理作用研究[j].中药药理与临床，2007，23(5)：1035-1036.
