作者：胡耀华,钟文彬,周林,黄树林
【摘要】 目的 建立高效毛细管电泳法测定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸的分析方法，测定细菌代谢产物中的小分子有机酸。方法 采用毛细管：beckman coulter未涂层50 μm×60 cm (有效长度50 cm);缓冲溶液：ph 10.5的10 mmol/l(含0.5 mmol/l ctab)的硼砂溶液;检测波长214 nm，分离电压-20 kv，进样压力为1.0 psi，进样时间为10 s。结果 4 min内甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸得到基线分离。线性范围分别为：甲酸3.8～30.7 mg/l (r=0.997 1);乙酸3.3～52.5 mg/l (r=0.996 1);丙酸3.1～49.5 mg/l (r=0.999 3);丁酸3～48 mg/l (r=0.992 5);乳酸7.5～60.5 mg/l (r=0.999 5)。平均回收率分别为: 甲酸99.29%(rsd=0.67%);乙酸98.90%(rsd=1.36%);丙酸99.65%(rsd=0.65%);丁酸99.35%(rsd=0.42%);乳酸98.06%(rsd=1.44%)。Www.11665.CoM结论 该方法简单、快速、准确，可用于细菌发酵液中代谢产物有机酸的检测。
【关键词】 细菌代谢产物 小分子有机酸 高效毛细管电泳
abstract:objective to establish a method for determining formic acid,acetic acid,propionic acid,butyric acid and lactic acid in bacterial metabolites by the highperformance capillary electrophoresis. methods samples were analyzed on a beckman coulter (50 μm ×50 cm) uncoated fusedsilica capillary using 10 mmol/l borate buffer ( ph 10.5,containing 0.5 mmol/l ctab). the uv detection wavelength was 214 nm,the separation voltage -20 kv and injection pressure 1.0 psi×10 s. results standard samples of formic acid,acetic acid,propionic acid,butyric acid and lactic acid were separated well in 4 minutes,and their linear ranges were 3.8-30.7 mg/l (r=0.997 1),3.3-52.5 mg/l (r=0.996 1),3.1-49.5 mg/l (r=0.999 3),3.0-48.0 mg/l(r=0.992 5),7.5-60.5 mg/l (r=0.999 5),respectively,their average recoveries were 99.29%,98.90%,99.65%,99.35% and 98.06%,respectively. the rsd values (n=6) of formic acid,acetic acid,propionic acid,butyric acid and lactic acid were 0.67%,1.36%,0.65%,0.42%,1.44%,respectively. conclusion the method is simple,rapid and accurate for detecting the organic acids in bacterial metabolites in fermentation liquor.
key words:metabolic product;organic acid;highperformance capillary electrophoresis
代谢流量是细胞生理学的一个基本决定因素，也是代谢途径中最重要的参数。对细菌进行代谢流量分析，特别是代谢产物中小分子有机酸的分析，有助于通过基因工程手段定向地、有目的地改变限制细胞代谢的关键途径，以更好地理解和利用细胞代谢进行化学转化、能量转导和活性产物表达[1]。在发酵过程中，产酸发酵细菌能将有机物转化为以脂肪酸和醇为主的末端产物，同时生成新的细胞物质。产酸发酵速率较快，末端产物主要有甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸等脂肪酸以及醇类(乙醇等)、二氧化碳、氢气、氨、氮气等[2]。通过分析这些发酵末端产物可以了解细菌的代谢途径，而代谢通量的分析可以使所需要的一些关键操作单元协调运行，从而达到副产物最小而产率最优的目的[3]。
毛细管电泳(ce)是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，具有效率高、分离检测样本的速度快、所需要的样本和试剂少、检测的模式多且可以和其他技术联用、试剂易得廉价、能够实现自动化的优点，越来越广泛地被用于有机酸的分析[4]。影响有机酸分离的主要因素有：缓冲溶液的种类、缓冲溶液的ph 值、电渗流改性剂和添加剂、分离电压等。本研究建立了ce法(区带电泳分离模式)测定小分子有机酸的方法，并对缓冲溶液的种类、ph值以及添加剂等对电泳分离条件进行了研究，从而为研究细菌的代谢途径提供技术手段。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
高效毛细管电泳仪：beckman coulter p/ace mdq毛细管电泳系统(32karattm software ver 5.0) ，毛细管为beckman coulter未涂层50 μm ×60 cm (有效长度50 cm)。甲酸、乙酸(sigma公司，色谱纯)，丙酸、丁酸、乳酸(sigma公司，分析纯)，四硼酸钠、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)(广州市化学试剂厂，分析纯)。所有溶液均用超纯水配制和稀释，标准样品和缓冲液经0.22 μm滤膜过滤后进样。
1.2 方法
1.2.1 毛细管电泳环境的平衡 每次进样前毛细管先用水洗3 min，再用0.1 mol/ l的naoh溶液冲洗3 min，水洗3 min，然后再用缓冲液冲洗5 min。每次更换试样时均用缓冲液清洗5～10 min，所需时间以基线平稳为准。
1.2.2 检测波长的选择 以190～250 nm为检测波长，检测各种有机酸和运行缓冲液的紫外吸收特性，选择各有机酸吸光度相对较大、而缓冲液吸光度相对较小的波长为检测波长。
1.2.3 缓冲液浓度的选择 采用214 nm检测波长，分离电压-20 kv，进样压力为1.0 psi，进样时间为10 s，在ph值为10.5的情况下，评价 10～25 mmol/l的硼砂缓冲体系。
1.2.4 缓冲液ph的选择 分别以ph 9.0、ph 9.5、ph 10.0、ph 10.5、ph 11.0的缓冲溶液进行分离，各有机酸分别进样，以缓冲液ph值对各有机酸的保留时间作图。
1.2.5 分离电压的选择 分别以10、15、20、25 kv为分离电压进行分离，各有机酸分别进样，以分离电压对各有机酸的保留时间作图。
1.2.6 分离温度的选择 分别以15、20、25、30、35 ℃为分离温度进行分离，各有机酸分别进样，以分离柱温对各有机酸的保留时间作图。
1.2.7 各种有机酸标准样品的定性和定量 将各种单一有机酸液依次进样,记录各自保留时间。以上述优化结果为实验条件，5种不同浓度有机酸从低浓度至高浓度依次进样，计算各自的峰面积(每个样品平均进样3次)，以有机酸浓度对峰面积作图,建立标准曲线。
1.2.8 有机酸混合样品的分析 配制不同浓度的有机酸标准混合液进行定量分析，积分计算峰面积，比较计算值与实际值的误差，得出样品回收率和检测精确度，论证分析方法的准确性和重复性[5]。
2 结 果
2.1 发酵液中小分子有机酸的紫外吸收特性
大多数有机酸在200 nm以上无吸收或吸收很小，用间接紫外检测时其背景电解质吸收要求尽可能低。缓冲溶液中硼砂的紫外吸收较低，因此试验了硼砂溶液的紫外吸收特性。图1、图2分别为各种有机酸标准样品和背景电解质硼砂的紫外吸收光谱。结果表明：当波长小于220 nm时，大多数有机酸都有紫外吸收;当波长小于210 nm时，背景电解质的紫外吸收增加很快，影响有机酸的测定。综合考虑，选择214 nm作为检测波长，在该检测波长处常见有机酸都有比较理想的吸收值。
2.2 电渗流改性剂对分离的影响
有机酸阴离子的电泳方向与电渗方向相反，通常加入阳离子表面活性剂使电渗反向，从而与有机酸阴离子的电泳方向一致，以缩短分析时间。因此本实验在缓冲液中加入0.5 mmol/l的ctab作为电渗流改性剂。实验发现，在未加ctab之前，5种有机酸在20 min内才能得到分离，加入ctab后时间缩短到5 min。
2.3 最佳反应体系的建立
2.3.1 缓冲液浓度的选择 在大多数情况下，随着缓冲液浓度的增加，离子强度增加，电渗流速度降低，溶质在毛细管内的迁移速率下降，迁移时间延长。而且随着缓冲液浓度的增加，导电的离子数增加，在相同的电场强度下毛细管的电流值增大，焦耳热增加。实验考察了不同浓度的硼砂对分析物的影响，分离结果见图3。结果表明，当硼砂浓度从10 mmol/l 增加到20 mmol/l 时，保留时间呈上升趋势;当浓度大于20 mmol/l时，保留时间有所下降;在20 mmol/l时，保留时间最长。为保证体系的稳定性，节约分离时间，提高检测灵敏度，选择10 mmol/l为硼砂缓冲液的最佳浓度。
2.3.2 缓冲液ph值的选择 缓冲溶液ph值的调节与控制是优化分离的重要因素。有机酸为弱酸，其pka值大多在2～6之间。分析物的电离度依赖于电解质溶液ph值的变化，电离度的不同引起电泳淌度和电渗流淌度的差异，进而影响分离效率和电泳迁移行为。由于在酸性介质中有机酸易被毛细管壁吸附，因而通常在碱性环境下实现分离。本研究选择ph 9.0～11.0进行实验，分离结果见图4。从图可见，当ph为10.5时，5种有机酸均可完全分离;随着ph的增大，分离度进一步得到改善，但同时使分离时间延长。综合考虑分离度、分离时间和灵敏度，选定硼砂缓冲液的最佳ph为10.5。
2.3.3 分离电压的选择 电压是控制柱效、分离度和分析时间的重要因素。分离电压的变化会引起电场强度的改变，进而影响组分的分离。本研究分别考察了电压在10～25 kv范围内的分离效果，结果见图5。结果表明，随着电压的增大，柱效提高，因而有机酸的分析时间缩短。但过高的电压会产生较大的焦耳热，导致区带展宽，峰面积下降，从而影响分离效率和分离度。综合比较不同电压下的分离图谱，发现在20 kv条件下各种有机酸均得到良好的分离而且保留时间适合，峰形也最好。
2.3.4 分离柱温的选择 柱温对电解质溶液的黏度、谱带扩展、离子淌度等有直接的影响。柱温试验发现：15～35 ℃区间的不同柱温下分离时间变化不大,但对各种有机酸的分离度有较大影响。在柱温为30 ℃时，各种有机酸的分离都能较好满足工作需要，因此选择30 ℃作为实验柱温。
2.3.5 最佳反应体系 综合以上各个优化条件，最终选用的毛细管分析体系为：214 nm为检测波长，10 mmol/l (含0.5 mmol/l ctab)的硼砂作为缓冲溶液，ph值为10.5，分离电压为-20 kv，进样压力为1.0 psi，进样时间为10 s。
2.4 各种有机酸标准样品的定性与定量
将各种单一有机酸液依次进样，记录各自的保留时间：甲酸为2.68 min，乙酸为3.02 min，丙酸为3.13 min，丁酸为3.25 min，乳酸为3.47 min。
以上述优化结果为实验条件，5种不同浓度有机酸从低浓度至高浓度依次进样，计算各自的峰面积(同一批次每个样品平均进样3次取平均值，系列实验重复6次)，以有机酸浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作图，建立标准曲线，计算相关系数并建立回归方程，见表1。从表1中的线性回归方程可知，在实验样品的浓度范围内，各种有机酸的线性关系良好，用该种方法定量准确度可以得到保证。
2.5 有机酸混合样品的分析
配制有机酸标准品混合液,根据已确定的各项实验参数进行分析,电泳分析图谱见图6。通过积分计算峰面积，再返回标准曲线对照，得出各种有机酸的含量及样品回收率和检测精密度，见表2。表1 有机酸工作曲线的特征参数表2 有机酸标准品混合液中各有机酸的含量及回收率
3 讨 论
毛细管电泳自问世以来，主要用于药品、氨基酸、核酸等物质的分离检测。从本文结果可见，在利用毛细管电泳进行分离分析时，缓冲液的种类、浓度、ph值和分离电压、柱温都对分离有重要的影响。适量电渗流改性剂ctab的加入明显增进电迁移速率，缩短分离的时间。缓冲液的ph值对分离的影响最大，ph值不仅影响色谱峰的形状和有机酸样品的保留时间，更重要的是，不适合的ph条件根本不能使各有机酸得到分离。分离电压的提高主要是影响到有机酸的保留时间，同时如果过高电压导致产生的焦耳热也会影响峰形。实验表明所建立的方法简单、快速、准确、重复性好，适用于发酵过程中代谢产物的监控及发酵过程工艺参数的优化。
【参考文献】
[1] stephanopoulos g n, aristidou a a, nielsen j,et al. metabolic engineeringprinciples and methodologies [m].new york: academic press,1998: 5-8.
[2] 任南琪,王爱杰,马放. 产酸发酵微生物生理生态学[m]. 北京：科学出版社,2005: 4-13.
[3] harada k, fukusaki e, kobayashi a. pressureassisted capillary electrophoresis mass spectrometry using combination of polarity reversion and electroosmotic flow for metabolomics anion analysis[j]. j biosci bioeng,2006,101(5): 403-409.
[4] 李玉珍,尹洧. 毛细管电泳在生命科学研究中的应用(1)[j].生命科学仪器,2005,3(3): 9-12.
[5] 范国荣,胡晋红,李博华,等. 四倍体板蓝根中五种有机酸成分的毛细管电泳分离分析[j].中国药科大学学报,2000,31(2):111-114.
