作者：陈芳超,郭姣,杨超燕,龚梦鹃,卢晓萍,唐春萍
【摘要】 目的 探讨复方贞术调脂胶囊对大鼠非酒精性脂肪肝的影响,为其临床用药提供依据。方法 取sd大鼠60只,随机分成正常组、模型组、复方贞术调脂胶囊高、中、低组、非诺贝特组。除正常组外,其他组采用高脂乳剂灌胃复制大鼠非酒精性脂肪肝模型,造模同时复方贞术调脂胶囊高、中、低组、非诺贝特组连续给药8周后,测定肝脏胆固醇（tc）、三酰甘油（tg）,并计算肝指数,光镜下观察肝脏病理学变化。结果 复方贞术调脂胶囊能降低肝脏tc和肝指数。肝脏病理切片结果显示复方贞术调脂胶囊组肝细胞脂肪变性、水样变性及坏死和炎症细胞浸润等病理表现均有所减轻,明显轻于模型组。结论 复方贞术调脂胶囊对非酒精性脂肪肝有较好的防治作用。
【关键词】 复方贞术调脂胶囊 非酒精性脂肪肝 病理 肝指数
abstract:objective to study the effects of compound zhenzhu tiaozhi capsules on nonalcoholic fatty liver disease (nafld) in rats. methods 60 sd rats were randomly divided into 6 groups: normal group, model group, compound zhenzhu tiaozhi capsules high dose group, moderate dose group, low dose group, and the fenofibrate group. rats model with nonalcoholic fatty liver disease were established with administration of high fat emulsion by gavage. the rats in the treatment groups were administered with test drugs．after 8 weeks，liver cholesterol (tc), triglyeride (tg) were determined and liver index was calculated. pathological changes in liver were observed by light microscopy. results the liver tc and liver index of the rats administered with compound zhenzhu tiaozhi capsules were significantly reduced, and pathological changes were significantly ameliorated in the rats administered wit compound zhenzhu tiaozhi capsules. conclusions compound zhenzhu tiaozhi capsules has better therapeutic effects on nonalcoholic fatty liver disease in rats．
key words:compound zhenzhu tiaozhi capsule; nonalcoholic fatty liver; pathology; liver index
近年来,随着人们饮食结构、生活方式的改变,肥胖症、糖尿病、高脂血症患者日益增多,导致非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，nafl）的发病率也逐年增加,已成为现今社会的多发病、常见病［1］。wWW.11665.CoM研究表明：nafl在较短期内可发展为不可逆的肝损害,其肝纤维化的发生率高达25％［2］。因此积极发现和防治脂肪肝对阻止慢性肝病进展有着十分重要的意义。
脂肪肝多伴有高脂血症,大部分需要降血脂治疗［3］。复方贞术调脂胶囊为我院郭姣教授经验方, 临床具有较好的降血脂疗效。该组方已获得国家发明专利授权(zl2004100512504）,前期实验中已证实复方贞术调脂胶囊具有调节血脂代谢异常作用,对高脂血症有防治作用［4］。在此基础上，本实验旨在进一步探讨复方贞术调脂胶囊对高脂饮食诱导的nafl大鼠肝脏脂质和肝脏病理学形态变化的影响,为临床治疗非酒精性脂肪肝提供科学依据。
1 实验材料
1.1 主要试剂
脱氧胆酸钠:国药集团化学试剂有限公司,批号f20070521；丙硫氧嘧啶:广东华南药业有限公司,批号070501；胆固醇:天津大茂化学试剂厂,批号20070518； 吐温80:上海申宇医药化工有限公司,批号061201；1,2丙二醇:广州化学试剂厂,批号2005/2031； tc试剂盒: 中生北控生物科技股份有限公司,批号070471； tg试剂盒:中生北控生物科技股份有限公司,批号071761。
1.2 药物
复方贞术调脂胶囊:1.74 g生药/粒,由广东药学院药物研究所提供；非诺贝特:法国利博尼制药公司,批号:90383。
1.3 仪器
fa2104型上皿电子天平:上海精密科学仪器有限公司；tg16ga高速离心机:上海安亭科学仪器厂；uv1800型紫外可见光光度计:北京瑞利分析仪器公司；dks26型电热恒温水浴锅:上海精密实验设备有限公司；显微镜: olympus cx21。
1.4 动物
spf级sd大鼠,由广东省医学实验动物中心提供,合格证号:2007a003。
2 方法
2.1 高脂乳剂的制备
制备方法根据文献［5］报道方法加以改进。取25 g猪油,加热到100 ℃左右使其溶解,加入10 g胆固醇,搅拌至完全溶解;再加入1 g丙硫氧嘧啶和25 ml吐温80,充分搅匀。在另一烧杯中加入蒸馏水30 ml和 1,2丙二醇20 ml,加热至60 ℃,加入脱氧胆酸钠2 g,充分搅拌直至溶解。将两种溶液充分混匀,制成高脂乳剂。
2.2 动物分组
取60只sd大鼠,体质量180～220 g,随机分为6组,每组10只，即正常组、模型组、复方贞术调脂胶囊高剂量组（6.4 g生药/kg）、中剂量组（3.2 g生药/kg）、低剂量组（1.6 g生药/kg）和非诺贝特组（40 mg/kg）。除正常组自由摄取普通饲料外,其余组分别在此基础上每天上午按10 ml/kg量灌胃给予高脂乳剂,4 h后各给药组分别灌胃相应药物,正常组、模型组给予等量生理盐水,连续给药8周。
2.3 检测指标及检测方法
2.3.1 肝指数和肝组织病理形态学检查 末次给药1 h后,脱臼处死大鼠,立即摘取肝脏,用冰生理盐水清洗,滤纸吸干,用分析天平称其湿重后,计算肝指数（肝指数=肝湿重/体质量×100）。再在肝左叶取一块3 cm×3 cm肝组织,用10％（φ）甲醛溶液固定,常规石蜡包埋、切片、he染色,光学显微镜下观察细胞脂肪变性程度。肝脏细胞脂肪变性按以下标准判断 ［6］：低倍镜观察含脂滴细胞数与总细胞数，二者比值划分为0,<1/3,1/3～1/2,1/2～2/3,>2/3,相应脂肪病变等级为（-）、（+）、（++）、（+++）、(++++),若含脂滴细胞数与总细胞数之比值>1/3即诊断为脂肪肝，其中占肝小叶1/3～1/2为轻度脂肪肝；占肝小叶1/2～2/3为中度脂肪肝；占肝小叶2/3以上或肝细胞弥漫脂肪变性呈鱼网状为重度脂肪肝。
2.3.2 肝脏脂质测定 称取相同部位肝脏组织0.5 g,并剪碎,用提取液(氯仿∶甲醇=1∶1体积比)制成匀浆后，提取液定容至5 ml,混匀。经24 h震荡抽提, 3 000 r/min离心5 min得上清液,分别采用氧化酶法、磷酸甘油酶法测定肝脏中tc、tg。
2.4 统计学处理
用spss 10.0统计软件进行统计,数据以±s表示,各组间比较采用方差分析,等级数据用ridit分析,p<0.05为差异有显著性。
3 结果
3.1 复方贞术调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏病理的影响
3.1.1 肉眼观察 正常组大鼠肝脏外观正常,颜色鲜红,有弹性,被膜光滑,无病变迹象。模型组动物肝脏体积明显增大,包膜紧张,边缘变钝,表面无光泽,呈局灶性黄白色变性灶,切面有明显油腻感,呈奶黄色，呈典型脂肪变。复方贞术调脂胶囊高、中剂量组较模型组有明显改善,肝脏颜色、质地均接近正常。复方贞术调脂胶囊低剂量组较模型组有所改善,肝脏颜色偏黄,有一定光泽度,肿胀程度较模型组轻,切面有油腻感。非诺贝特组体积增大,质地较脆。
3.1.2 光镜观察 正常组：大鼠肝小叶结构明显,汇管区清晰可见,肝细胞索呈放射状排列,肝窦正常,中央静脉内皮细胞清晰可见,肝细胞形态规则,呈多边形整齐排列,胞浆染成红色,均匀。肝细胞核位于细胞中央,胞核清晰。肝细胞无变性。 模型组：肝组织有明显脂肪变性和水样变性，肝小叶结构不明显,肝索完全解离,肝窦狭窄或消失,中央静脉扩张,内皮细胞缺失。肝细胞肿大,细胞核被挤压变形,部分严重者脂滴融合,将细胞核挤到细胞一边、部分消失。胞浆染色不均匀,部分消失,充满大量脂肪空泡。间质组织中有炎症反应,局部有淋巴细胞和浆细胞的浸润。
复方贞术调脂胶囊高、中剂量组较模型组脂肪变性和水样变性程度明显减轻,炎症反应减轻,肝小叶结构仍可见,肝索轻微变形,只有部分肝细胞水样变性,大部分肝细胞接近正常形态。
复方贞术调脂胶囊低剂量组、非诺贝特组较模型组脂肪变性程度和水样变性减轻,肝小叶不明显,肝窦变窄或消失,部分细胞水样变性,非诺贝特组有少数动物肝细胞内有脂滴空泡。见图1。
3.1.3 复方贞术调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏细胞脂肪变性情况的影响 结果表明：复方贞术调脂胶囊高、中、低剂量组以及非诺贝特组均能改善肝脏组织病变,与模型组比较差异有显著性（p<0.05）。见表1。
a.正常组; b.模型组; c.复方贞术调脂胶囊高剂量组；d. 复方贞术调脂胶囊中剂量组; e.复方贞术调脂胶囊低剂量组; f.非诺贝特组
图1 贞术调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠病理形态学的影响（he×400）（略）
figure 1 effects of compound zhenzhu tiaozhi capsules on pathomorphological changes of rats with nonalcoholic fatty liver disease
表1 复方贞术调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞脂肪变性程度的影响（略）
table 1 effects of compound zhenzhu tiaozhi capsules on degree of steatosis of liver cells in nafld rats
ridit分析:与模型组比较
3.2 复方贞术调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠大鼠肝脏脂质的影响
与正常组比较，模型组肝脏tc显著升高（p<0.01），复方贞术调脂胶囊高、中剂量、非诺贝特组可降低肝脏tc,与模型组比较差异有显著性(p<0.05)。提示复方贞术调脂胶囊能调节肝脏脂质水平。见表2。
3.3 复方贞术调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏指数的影响
与正常组比较，模型组肝指数显著升高（p<0.01）。复方贞术调脂胶囊高、中剂量组均能降低肝指数,与模型组比较差异有显著性,其中高剂量组优于非诺贝特组（p<0.05）。见表3。
表2 复方贞术调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏脂质水平的影响（略）
table 2 effects of compound zhenzhu tiaozhi capsules on liver lipid level in nafld rats
与模型组比较:*p＜0.05,**p<0.01
表3 复方贞术调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠肝指数的影响（略）
table 3 effects of compound zhenzhu tiaozhi capsules on liver index in nafld rats
与模型组比较:*p＜0.05,**p<0.01;与非诺贝特组比较:δp＜0.05
4 讨论
肝脏是脂质代谢的重要部位,参与除乳糜微粒以外的所有脂蛋白的合成、分解降解过程,在正常生理状态下，脂类代谢在一定范围内可在机体严密调控系统调节下保持相对平衡。膳食中高脂物质的过量摄入以及缺乏运动等原因,可引发肝脏脂质代谢障碍,导致脂肪在肝细胞内中聚集,导致nafl［7,8］。nafl又称非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，nafld)，它是一种无过量饮酒史肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征［9］。富余脂质的沉积是nafl形成发展的先决条件之一［10］。
目前国内常采用高脂饲料诱导非酒精性脂肪肝模型，而通过灌胃给予高脂乳剂，则可以避免动物因摄食高脂饲料不均造成个体间脂质水平差异过大的缺点［11］。本实验结果显示，模型组肝脏指数、tc显著升高,tg变化不明显,肝细胞出现脂肪变、水样变、炎症细胞浸润等病理变化，表明长期灌胃给予高脂乳剂可以建立以tc升高为主的非酒精性脂肪肝病动物模型,这与张龚之等［12］的nafl和酒精性脂肪肝（afl）大鼠肝脏脂质对比实验结论一致，说明nafl造模成功。
中医认为：肝失疏泄，脾失健运，肾精不足，湿热内结，痰浊郁结，淤血阻滞，而最终形成痰湿淤阻互结，痹阻肝脏脉络而形成脂肪肝［13］。复方贞术调脂胶囊由女贞子、白术、丹参、黄连、佛手等药组成, 具有疏肝理气、健脾利湿、化痰降浊、活血化淤等功效。本研究结果表明:复方贞术调脂胶囊可降低肝脏中tc水平,减轻大鼠肝细胞脂肪变性程度，提示复方贞术调脂胶囊能减少非酒精性脂肪肝大鼠肝组织的脂肪沉积,改善病理学损害,对非酒精性脂肪肝具有防治作用。
降脂药物在脂肪肝治疗中的地位,目前仍有异议［14］。文献［15］报道降脂药非诺贝特能增加脂蛋白脂酶活性,减少极低密度脂蛋白在肝脏中的合成与分泌,用于nafl的治疗,但对肝脏功能有损伤,本实验中也观察到非诺贝特能降低肝脏脂质,一定程度上改善病理学损害,但与对照组相比，肝脏仍有肿大现象,肝指数并没有降低,因此非诺贝特治疗脂肪肝的作用尚需进一步探讨。
【参考文献】
［1］ 荆雪,高普均.非酒精性脂肪肝的实验室检查［j］.现代消化及介入诊疗，2007,12(4):262-263.
［2］ angulo p,lindor k d.treatment of nonalcoholic fatty liver:present andemerging herapies［j］.semin liver dis,2001,21(1):81-88.
［3］ 谢晨,解莹,刘文芝.浅谈脂肪肝的降脂治疗［j］.医学与哲学,2007,28(1):18-19.
［4］ 唐春萍,郭姣,杨超燕,等.调脂灵对高脂血症大鼠脂代谢酶及载脂蛋白的影响［j］.广东药学院学报,2007,23(2):175-177.
［5］ 郭姣,唐春萍,陈宝田,等.不同提取工艺的调脂康对血脂异常大鼠模型的调脂作用研究［j］.中国实验方剂学杂志,2006,12(6):62-63.
［6］ fan j g,zeng m d.fatty liver disease［m］.beijing:people’s medical publishing house,2005:147.
［7］ 郭宏岩,秦静林,薛晓峰,等.高脂血症与肝脏损害［j］.中国社区医师,2002,18(18):20-21.
［8］ 彭丽红,阳学风.ppar与脂代谢及脂肪肝的关系［j］,南华大学学报:医学版,2006,34(5),673-676.
［9］ 中华医学会肝脏病学会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪肝病诊断标准［j］.中华肝脏病杂志,2003,11(1):71.
［10］ 敬晓琴,袁特.非酒精性脂肪肝的研究进展［j］.胃肠病学和肝病学杂志, 2008,17(6):509-516.
［11］ 张志平,尤婷婷,邹丽宜,等.复方丹参合剂对长期脂肪乳剂灌胃诱发的大鼠非酒精性脂肪肝病的影响［j］.南方医科大学学报,2008,28(7):1109-1113.
［12］ 张龚之,张红,张燕,等.酒精性与非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏脂质及血脂等指标的比较［j］.新疆医科大学学报,2008,31(7):796-798.
［13］ 乔娜丽,杨钦河,纪桂元,等.论肝郁脾虚是脂肪肝的基本发病病机［j］.时珍国医国药,2008,18(5):1238-1239.
［14］范建高,李继强,曾民德.脂肪肝的药物治疗进展［j］.中华肝脏病杂志,1996,4(4):248-250.
［15］ 池肇春. 非酒精性脂肪肝的治疗［j］.青岛医药卫生,2003,35(5):360-363.
