作者：杨剑,崔淑兰,龙友明,陈垦,王晖,王念林,谢文瑞,刘君君
【摘要】 目的 观察核因子κb必需分子(nfκb essential modulator，nemo)结合的小分子多肽(micromolecule polypeptide combining with nemobinding domain，nbd多肽)对实验性大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用。方法 60只sd大鼠随机分成治疗组、对照组各30只，采用三硝基苯磺酸(tnbs)灌肠法制作溃疡性结肠炎大鼠模型，治疗组予腹腔注射1.3 mg/100 g体质量的nbd多肽，对照组予等量生理盐水，评估炎症活动指数（iai），给药后7 d处死相应组的动物取结肠，肉眼观察结肠黏膜病变且按损伤情况积分，行病理切片、苏木素伊红(hematoxylin eosin，he)染色，光镜下评估组织损伤；取病变结肠组织切片行免疫组化检测核因子κb(nfκb)表达，检测髓过氧化物酶(mpo)、丙二醛(mda)。结果 治疗组大体形态损伤、组织学损伤评分、iai评分分别为2.41±0.43、4.80±0.82、6.02±0.59，明显低于对照组(3.50±0.51、6.90±1.13、3.05±0.51)(p<0.05)；治疗组mda、mpo及nfκb表达均低于对照组(p<0.05)。WWw.11665.CoM结论 nbd多肽对于溃疡性结肠炎大鼠模型有较好的治疗作用，其作用与其抑制nfκb表达有关。
【关键词】 nbd多肽 溃疡性结肠炎 动物模型 nf κb 免疫组化
abstract:objective to observe the timeactivitycurve of the therapeutic effect of micromolecule polypeptide combining with nemobinding domain on experimental ulcerative colitis rat. methods sixty sd rats were randomly divided into treated and control group. ulcerative colitis rat model was induced by enteroclysis with trinitrobenzenesulfonic acid(tnbs)， micromolecule polypeptide combining with nemobinding domain were administered by intraperitoneal in treated group， and ejust doses liquor natrii chloridi isotonicus were administered likely in control group. iai score were evaluated. assay．then the rats were killed according to groups in 7 days after that the model was made for the observation of the colonic pathologic changes by naked eye and for the estimation of the damage scores of colon mucosa. finally，the colon tissue was fixed to make pathological section and the damage score of tissue was observed under microscope. and then damaged colon tissues pathological section test expression of nfκb by immunizing histochemistry. then the value of mda、mpo in supernatant of sampless damaged colon tissues divide evenly an oar were tested according to the instruction of the corresp kit. result the treated groups briefly form damage scores、damage scores of tissue、iai score are 2.41±0.43、4.8±0.82、6.2±0.59， and they all are lower than that of the control group(3.5±0.51、6.9±1.13、3.05±0.51) (p<0.05). and the value of the the treated groups mpo、mda、nfκb are lower than that of the control group (p<0.05). conclusion micromolecule polypeptide combining with nemobinding domain has protective effect against rat ulcerative colitis，and its mechanism relat with the inhibitjion of nuclear factor κb.
key words:nfκb essential modulatorbinding domain (nbd) peptide; ulcerative colitis; animal model; nfκb; immunohistochemistry
溃疡性结肠炎(uc)即慢性非特异性溃疡性结肠炎，是一种病因尚未完全明确的直肠和结肠的慢性炎症性疾病，病程迁延，有癌变趋势，近年来患病率呈上升趋势。目前研究发现核转录因子κb（nuclear factor κb，nfκb）参与了炎症性肠病(inflammatory bowel disease，ibd)的发病机制和病理生理过程，并在ibd发病过程中起着核心作用，是ibd炎症级联放大效应及“瀑布样效应”的“开关”［1］。目前治疗本病的药物主要为氨基水杨酸类、 肾上腺皮质激素类、免疫调节剂等，取得了一定的治疗效果，但毒副作用较大。nbd多肽可以选择性抑制nfκb基因的表达，抑制促炎症基因的表达，抑制自身炎症反应，有很好的应用前景，而目前国内、外尚未有应用nbd治疗实验性ibd的研究，故利用tnbs诱导的大鼠uc模型进行了nbd多肽治疗的实验研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 sd大鼠60只， spf级，雄性，体质量180～220 g， 由广东医学院实验动物中心提供，合格证号：粤监证字2005a010。
1.1.2 药物 nbd多肽，美国sigma公司生产。
1.1.3 试剂 三硝基苯磺酸(tnbs)：美国sigma公司生产，批号：p2297；髓过氧化物酶（mpo）测试盒及丙二醛(mda)测试盒，南京建成生物工程研究所，批号均为040722；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供，批号20060814。兔抗nfκb多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司提供。sp试剂盒和二氨基联苯胺(diaminobenzidine，dab)试剂盒均购自上海西唐生物工程有限公司；无水乙醇、乙醚甲醛均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 结肠炎动物模型的制备 大鼠在试验前1 d禁食，用10%（φ）氨基甲酸乙酯(乌拉坦)0.1 ml/kg腹腔注射麻醉。将2，4，6tnbs溶于50%乙醇（φ）中至终浓度为100 g/l，取聚丙烯导尿管1根，术前用液状石蜡润滑后，从大鼠肛门中插入深度约8 cm达结肠部位，缓慢灌注tnbs/乙醇溶液，每只大鼠约0.3 ml，制成大鼠溃疡性结肠炎模型。
1.2.2 动物分组与给药方法 60只雄性大鼠随机分成治疗组和对照组，每组各30只。治疗组在造模前给予腹腔注射1.3 mg/100 g体质量的nbd多肽1次，对照组在造模前给予腹腔注射1.3 ml/100 g体质量的蒸馏水1次，待大鼠清醒后给予正常饮食，于造模后7 d处死两组大鼠并取结肠标本及血标本。
1.2.3 结肠炎症的评价 在各时间点进行iai评分，而后处死大鼠取病变结肠进行大体形态损伤、组织学损伤评分、病理切片+he染色及mpo、mda活性测定。感染活动指数（inflamation active index，iai）评分，iai=(体质量下降分数+大便性状分数+便血分数)/3；正常大便成干而小粒状，半稀便为糊状但不粘肛门，稀便为液状而且粘肛门；大体形态损伤按luk等［2］的标准；组织学损伤按韩英等［3］的标准；常规病理切片+he染色；mpo、mpa活性测定按试剂盒说明书盘(南京建成生物工程程公司)说明书操作。
1.2.4 nfkb表达的检测及评分 用免疫组化sp法检测，取结肠病变部位组织，甲醛溶液固定后石蜡包埋，组织切片脱蜡；将玻片置柠檬酸缓冲液中用医用微波炉进行抗原修复，水洗；滴加30 ml/l的h2o2室温10 min阻断内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，pbs)冲洗；正常血清在室温下封闭15 min，清除多余血清；滴加兔抗nfκb p65多克隆抗体37℃孵育1 h，pbs液冲洗；滴加生物素化的兔抗羊ig抗体室温孵育15 min，pbs液冲洗：滴加过氧化物酶标记的链霉亲和素室温孵育15 min，pbs液冲洗；dab显色2～5 min，苏木素复染后，封片观察。pbs代替一抗作为空白对照，细胞染成黄色者为阳性，定位于细胞质和(或)细胞核。每张片随机选取10个高倍视野(×400)，用美国nikon spot图像采集处理系统采图后，采用imagepro plus 5.0专业图像分析软件进行图像分析，计算阳性细胞百分率（%）和平均吸光度（a）。
1.3 统计处理 采用spss 15.0软件进行统计学分析，实验数据以±s表示，采用t检验，p<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 两组大鼠大体形态与组织损伤 tnbs诱导的大鼠溃疡性结肠炎模型病变主要在近肛门段结肠及降结肠，对照组大鼠可见结肠黏膜充血水肿、糜烂及溃疡形成，部分肠段肠壁增厚，且病变呈现连续分布；将病变组织切片经he染色后，镜下可见结肠黏膜溃疡及伪膜形成，隐窝和黏蛋白减少或消失，淋巴细胞和中性粒细胞浸润，部分小鼠肠段还有纤维化形成，浸润深度可达固有层或以下，而治疗组病变则主要在黏膜层，病变明显较轻。两组评分比较差异有显著性 (p<0.01)， 提示nbd多肽对tnbs诱导的结肠炎症具有治疗作用，见表1、图1。
2.2 两组大鼠炎症活动指数(iai) 两组大鼠在灌肠苏醒后均逐渐出现懒动、拱背、厌食、体质量下降、大便次数增多，主要为稀便和脓血便，但治疗组症状明显轻于对照组，差异有显著性(p<0.01)，说明nbd多肽对tnbs诱导的结肠炎症具有治疗作用。见表1。
2.3 两组大鼠mpo、mda活性测定 经nbd多肽处理的大鼠mpo、mda活性明显下降，说明nbd多肽对溃疡性结肠炎局部组织细胞内的过氧化状态有抑制作用，减少氧化应激，对结肠炎症进展有抑制作用，见表1。
2.4 两组大鼠nfκb的表达 其主要表达于表皮、隐窝上皮细胞和巨噬细胞等。治疗组胞质中多呈棕黄色而胞核中为淡黄色，对照组胞质多为深棕黄色，阳性细胞百分率（%）和a值明显降低，两组比较差异有显著性 (p<0.01)，说明对照组的nfκb表达较为活跃，前炎症介质生成活跃，炎症比较严重。见表1、图2。
表1 两组各项指标评分结果（略）
table 1 scores of every index of two groups
与对照组比较：*p<0.01
图2 免疫组化结果 (sp×200) （略）
figure 2 immunohistochemistry (sp×200)
3 讨论
目前认为，溃疡性结肠炎发病机制与现核旁型抗中性粒细胞抗体(antineutrophil cytoplasmic antibodies，panca)［4］、nfκb基因编码nfκb p105/p50异构体的功能多态性、过氧化物酶体增生物激活受体(ppar)、tnfα、il1，6，8等促炎转录及其相关转录因子、炎性因子［5］、氧化应激损伤等多种因素多种机制的作用有关。本课题组研究已证实tnbs/乙醇所诱导的大鼠ibd模型中nfκb活性在炎症的不同时间点均异常激活，调节黏附分子等炎性基因的表达，参与疾病的发生发展［6］。
核因子nfκb是由sen等于1986 年首次从b细胞核提取物中发现的一种能与免疫球蛋白k轻链基因的增强子κb序列特异结合的蛋白因子。现证实其广泛存在于真核细胞内，能与多种细胞基因启动子或增强子序列特定位点发生特异性结合而促进转录和表达，与炎症反应、免疫应答以及细胞的增生、转化和凋亡等重要的病理生理过程密切相关。nfκb是重要的促炎转录因子，正常情况下以非活性态存在于胞浆中，在tnfα等胞内外因子作用下使iκb激酶催化对iκb磷酸化，nfκb产生核易位而激活，并进入细胞核内，结合于基因启动子5区含有κb结合位点的tnfα、il2、il6、il8、tnfb、粒巨噬集落刺激因子、b整合素、黏附分子等炎性因子的基因位点上，促进相应的基因表达、细胞因子释放；释放的细胞因子又可以反过来进一步活化nfκb［5，7］，形成正反馈调节，导致炎症反应失控，引起组织损伤［8］；抑制nfκb的表达可以减轻炎症，打断这种正反馈过程。但体内其他正常生理活动必需的细胞因子的转录也需要nfκb的活化，盲目地阻断nfκb的功能可干扰体内正常的生理过程，非特异性的nfκb抑制剂会产生严重副作用。
nfκb的激活所需要的ikk复合物中，iκkα和iκkβ有相似的结构与较高的同源性，c端调节酶活性的螺旋环螺旋结构域(helixloophelix，hlh)结构可使激酶发挥高效活性，但必须在其中的6个氨基酸的区域(nemobinding domain，nbd)与2种调节亚基iκkγ(也称nemo，nfκb essential modulator，nfκb必需调节物或iκkap，iκk associated protein，iκk连接蛋白)结合方能发挥作用。据此设计合成的只有6个氨基酸的长度 (h2nleuasptrpsertrpleucooh)的nemo结合的nbd多肽，可以选择性阻断两者的结合，阻断干扰ikkα、ikkβ与nemo的相互作用，选择性抑制nfκb活性，抑制促炎症基因的表达，从而改善ibd病情。而且由于其作用具有选择性，不至于影响nfκb的所有功能，并避免完全抑制nfκb的活性的毒副反应，且还具有分子结构小、活性极高、免疫原性低，进入细胞后不易被降解、设计、合成简便等优点，在具有良好的穿透性的透细胞性多肽载体帮助下可以顺利地进入细胞内发挥作用。
本实验中治疗组的nfκb表达较对照组明显下降，证实了nbd多肽能抑制nfκb的表达。治疗组的组织损伤、组织学评分均较对照组明显减轻，作为反映临床症状的iai评分也是如此，与nfκb的变化规律相同。mpo、mda作为反映组织氧化还原状态和氧化应激情况的指标，治疗组明显低于对照组，说明组织内过氧化压力减轻，氧自由基生成和造成的损伤降低，推测与nfκb表达受到抑制后炎症介质产生减少有关。
总之，nbd多肽对于溃疡性结肠炎有较好的疗效，有必要进行更大规模的实验来进一步证实。
【参考文献】
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