作者：李亚，王玉明，王丹，贺勇
【摘要】 目的：探讨汉族人群腺苷三磷酸结合盒转运体a1（abca1）基因单核苷酸多态性（snp）与血浆载脂蛋白a1（apoa1）水平的关系. 方法 ：选取abca1基因r219k, v825i, m883i和r1587k等4个编码区snps，采用pcr限制性片断长度多态性 分析 技术确定376名健康个体基因型；用thesias程序分析snps的连锁不平衡关系及单倍型. 结果：受检人群中，4种snps各自不同基因型个体间apoa1水平差异均未见统计学意义（p＞0.05）. r219k与m883i, v825i与m883i以及v825i与r1587k两两间存在连锁不平衡(p<0.01). 以v825i 和r1587k 构建的两位点单倍型中，ik单倍型携带者apoa1水平较vr单倍型携带者显著降低(p<0.05). 结论：abca1基因v825i和r1587k多态性与汉族人群血浆apoa1水平变化有关，但这种关联取决于该两个snps间形成的单倍型.
【关键词】 abca1基因；载脂蛋白a1；单倍体型；连锁不平衡
0引言
血浆高密度脂蛋白胆固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，hdlc）水平降低是冠心病的独立危险因素之一［1］. 腺苷三磷酸结合盒转运体a1（atpbinding cassette transporter a1，abca1）介导胆固醇、磷脂从肝外组织的流出，并通过与载脂蛋白a1（apolipoprotein a1，apoa1）相互作用，在胆固醇逆向转运和高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein，hdl）生成的起始阶段发挥着关键的作用，因此，abca1被认为是决定hdlc水平的主要因素之一［2］. 群体遗传学 研究 表明，abca1基因的某些单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，snp）可改变abca1蛋白活性并由此引起hdlc水平变化，从而 影响 个体对冠心病的易感性［3-4］. 然而，有关abca1基因snps对血浆apoa1水平影响的研究报道却相对缺乏.为此我们在本研究中探讨了abca1基因4种snps及其构成的单倍型与汉族人群apoa1水平变化的关系.
1对象和方法
1.1对象来自四川大学华西 医院 和成都医学院第一附属医院无血缘关系的四川地区汉族体检个体376（男194，女182）例，年龄(58.4±8.6)岁，apoa1水平（1.324±0.186） g/l，体质量指数（24.62±3.39） kg/m2，总吸烟率为27%，并经询问病史、体检、心电图等检查排除心血管疾病史.
1.2方法
1.2.1标本采集与处理禁食12 h后抽取研究对象外周血5 ml，采用免疫比浊法并按试剂盒（上海荣盛生物技术公司）推荐条件测定血浆apoa1水平；另采集外周血3 ml，1 ml acd抗凝，盐析法提取dna，te缓冲液溶解dna并置于4 ℃冰箱中备用.
1.2.2多态位点的基因型分型采用pcr限制性片断长度多态性分析法对4个snps进行分型. 首先，参照基因组序列（genbank登录号：nm005502）设计合成相应pcr引物，对受检者abca1基因r219k，v825i，m883i和r1587k等4个snps位点所包含的dna序列进行扩增；再取扩增产物15 μl，分别加入4 u限制性内切酶和2 μl 酶切缓冲液，并加超纯水至总体积20 μl，37℃水浴中保温16 h；最后，消化产物经30 g/l琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统分析电泳结果，判定个体基因型. pcr反应条件、限制性内切酶以及各基因型酶切情况见表1.表1abca1基因snps的基因型分型
统计学处理：每个snp的hardyweinberg平衡检验用χ2检验，在hwe软件上进行. 单个snp位点基因型与apoa1水平的关系分析采用协方差分析（用spss10.0软件）. snps间配对连锁不平衡估算以及各种单倍型与apoa1水平的关联分析均使用thesias程序进行. apoa1水平用x±s表示；除连锁不平衡检验用α=0.001为检验水准外，其余统计学分析均以p≤0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1等位基因和基因型的频率分布经χ2检验，4种snps各基因型频率在本研究人群中分布符合hardyweinberg平衡（p＞0.05），表明本研究样本具有群体代表性. 其中，变异型等位基因k219和i825的频率高于欧美人群（0.452 vs 0.27, 0.323 vs 0.056，p＜0.01）；而i883等位基因在欧美人群则为野生型等位基因［5］ （表2）. 表24种多态位点等位基因和基因型频率
2.24种snps不同基因型与apoa1水平的关系分析为准确地反映不同基因型对血浆apoa1水平的影响，我们采用了协方差分析，以排除各种混杂因素对研究结果的影响. 校正协变量（年龄、吸烟和体质量指数）后的结果显示，r219k, v825i, m883i和r1587k多态各自不同基因型个体间apoa1水平差异均无统计学意义（p＞0.05, 表3）. 表34种多态位点不同基因型个体间apoa1水平比较
2.3配对连锁不平衡分析abca1基因4个snps位点的配对连锁不平衡用统计量d′表示（d′=d/dmax）. 表4可见，在全部6个配对组合中，v825i分别与m883i和r1587k间存在较强的连锁不平衡（d′>0.7）. 此外，在r219k和m883i间也检测到有统计学意义的连锁不平衡（d′=0.572）. 值得注意的是，在r219k至r1587k位点约1.36 kb范围内，我们未发现2个以上的snps位点彼此间的连锁不平衡关系.
2.4abca1基因单倍型与apoa1水平的关联 分析 由于在分析区域内未检测到3或4个snps位点彼此间的连锁不平衡，我们仅以具有连锁不平衡关系的snps构建两位点单倍型，分析这些单倍型与apoa1水平变化的关系. 表5显示，以v825i 和r1587k构建的单倍型中，ik单倍型携带者其apoa1水平较vr单倍型携带者明显降低［-0.177（-0.269～-0.09），p=0.036］.表4abca1基因snps间配对连锁不平衡系数和统计学意义表5各种单倍型与apoa1水平的关联分析
3讨论
apoa1是hdl主要的载脂蛋白，占其整个结构蛋白的70%. 正如hdl水平与冠心病发生呈高度负相关［1］，个体apoa1水平降低，患冠心病风险也将随之增大. 因此，对apoa1代谢调控因素的 研究 也是冠心病病因学的重要 内容 . 研究发现，作为一种跨膜转运蛋白，abca1在促进胆固醇的细胞流出过程中需借助与apoa1间的相互作用，将先转运出的磷脂结合到apoa1上，形成磷脂apoa1复合物；然后再以该复合物为受体，接受从细胞中流出的胆固醇，进而形成新生的hdl；若转运至胞外的胆固醇量不足，导致磷脂apoa1复合物不能充分与之结合，则多余的apoa1将在肾脏中很快被清除［6］，提示abca1活性与血浆apoa1水平可能存在一定的相关性.
本研究结果表明，汉族人群abca1基因snps与apoa1水平变化的关系明显不同于欧美人群. 本研究中4种snps各自不同基因型个体间apoa1水平均未见显著性差异，提示汉族人群apoa1水平不与abca1基因上述单个snp位点直接关联.
此外，这种差异还反映在受检dna区域单倍型组成及其与apoa1水平的关系上. 欧美人群中，abca1基因r219k至m883i间各snp两两间处于强连锁不平衡状态（d′＞0.9），呈现出典型的单倍型模块（haplotype block）结构；而与之相距较远的r1587k则平衡传递［5］. 然而，本研究人群中对应的各snp位点间不仅连锁不平衡强度低于欧美人群，也未检测到2个以上位点彼此间的连锁不平衡. 我们基于连锁不平衡关系构建了两位点单倍型, 结果发现，在v825i和r1587k构建的单倍型中，ik单倍型携带者apoa1水平较vr单倍型携带者明显降低，提示由v825i和r1587k构成的单倍型与汉族人群apoa1水平变化具有相关性.
本研究结果与 文献 ［5］报道有较大差异. 我们认为，可能有以下3方面原因：首先，本文的资料来自汉族一般人群， 而tregouet等的研究对象则是冠心病患者， 二者脂蛋白代谢过程应该有所不同； 其次， 种族间的遗传背景差异也可能使相同的变异产生不同的表型效应； 另外， apoa1水平作为一种受多种因素 影响 的表型性状， 还可能与不同人群所处的生活环境有关.
【 参考 文献】
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