【摘要】 目的： 研究 ca组织中干扰素γ（ifnγ）和白介素4(il4)蛋白的表达情况并探讨其与尖锐湿疣复发和消退的关系. 方法 ：以12周内皮损有无复发作为标准分为复发组(22例)和未复发组（14例），以免疫组化sp法检测ca患者皮损中ifnγ和il4蛋白的表达. 并比较两组ifnγ和il4蛋白的表达情况. 结果：复发组中il4蛋白阳性率（81.2%）高于未复发组中il4蛋白的表达（50%）（p<0.05)；未复发组中ifnγ蛋白的阳性率（50.0%）高于复发组中ifnγ蛋白的阳性率（31.8%）（p<0.01）. 复发组il4蛋白表达程度积分(2.32±1.13)虽高于未复发组(1.57±1.45)，但其差别无统计学意义（p＞0.05）；而在未复发组中ifnγ蛋白表达程度积分（2.86±1.10）高于复发组中的表达（0.96±1.05）（p<0.01）. 结论：ca皮损局部不同il4蛋白表达差异对其预后无明显 影响 ,ifnγ表达增高可能有利于ca的消退.
【关键词】 尖锐湿疣 ； 干扰素γ； 白介素4
0引言
尖锐湿疣（ca）是一种常见的性传播疾病，20~24岁人群中年发病率达1.2％［1-2］， 治疗 后复发率较高，而临床上也能将看到部分患者皮损可自行消退［3］，提示机体不同的免疫状态对ca的发生和复发有一定的影响. 因此研究ca的复发和消退机制对其临床治疗具有重要意义. 有关hpv的免疫学研究发现，细胞免疫对于病毒的清除起主要作用. 国内外多项研究也发现ca患者外周血中th2细胞因子表达明显升高，th1型细胞因子表达下降［4-5］，而对ca皮损局部免疫状态研究较少. 我们用sp免疫组化法研究ifnγ和il4蛋白在不同预后ca患者皮损局部的表达情况，以探讨其与ca复发和消退的关系.
1对象和方法
1.1对象选择200301/03在我科首次就诊的ca患者36（男21，女15）例：年龄21~41（28.2±4.5）岁. 二氧化碳激光治疗前用手术刀切取ca患者的皮损保存，根据其治疗后随访12 wk内是否出现新发皮损分为未复发组(n=14)和复发组(n=22). 两组在年龄、性别和病变程度等方面均具有可比性. 以泌尿外科切除的15例正常包皮组织作为对照.
1.2方法治疗前手术刀切取ca患者的皮损后立即放入40 g/l福尔马林溶液中固定，经透明、浸蜡、包埋，然后连续5 μm厚切片，贴附于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上备用. 免疫组化sp试剂盒购自迈新生物技术公司；小鼠抗人ifnγ, il4单克隆抗体购自santa cruz公司. 病理切片常规脱蜡至水，滴1滴30 ml/l过氧化氢溶液，室温下阻断10 min，蒸馏水冲洗2 min×3次，微波炉内92~98℃保持10 min进行抗原修复，pbs冲洗5 min×3次，非免疫动物血清室温下封闭15 min，滴加ifnγ或il4单克隆抗体，室温孵育60 min或4℃过夜，pbs冲洗5 min×3次，加生物素标记的二抗，室温下孵育40~60 min，pbs冲洗5 min×3次,加链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶溶液，室温下孵育30~60 min, pbs冲洗5 min×3次, dab显色液显色. 阴性对照以双蒸水代替一抗作为质控标准.
1.3结果判定标准根据shimizu法改良而成，dab染色阳性细胞染成棕黄色. 着色范围以百分率记分：≤1%为0，2%～20%为1，21%～50%为2，≥51%为3；着色强度依据深浅记分：无着色为0，浅着为1，深着色为2. 上述两项相加为着色程度积分：≤1.9为阴性(-)，2～2.9为弱阳性(+)，3～3.9为阳性(). ≥4为强阳性().
统计学处理：组间表达阳性率比较采用精确概率法（fishers exact test）进行检验；表达程度积分值比较采用t检验. p<0.05为有统计学意义.
2结果
健康对照皮肤中ifnγ和il4蛋白呈阴性表达；ca患者皮损可见ifnγ和il4蛋白表达，主要表达于真皮浅层淋巴样细胞周围. 复发组中有18/22（81.2%）例表达il4蛋白， 未复发组中有7/14（50.0%）例表达il4蛋白，复发组il4蛋白表达率高于未复发组（p<0.05,图1)；复发组il4蛋白表达程度积分(2.32±1.13)也高于未复发组(1.57±1.45),但其差别无统计学意义（p>0.05）；复发组中有7/22（31.8%）例表达ifnγ蛋白，未复发组中有7/14（50.0%）例表达ifnγ蛋白，未复发组ifnγ蛋白的表达率高于复发组（p<0.01,图2），未复发组ifnγ蛋白表达程度积分（2.86±1.10）也高于复发组（0.96±1.05）（p<0.01）.
研究 发现，ca在 治疗 后3 mo有25％到67％可能复发［1］，多数有安慰剂对照的研究表明，有少量的ca却在发病后数月即使未经治疗也可自行消退［3］，两种现象形成鲜明的对照提示不同患者免疫状态的个体差异可能 影响 了ca的预后. 目前 对ca患者全身性免疫功能的研究较多，发现ca患者外周血的il2, il12, ifnα, ifnγ水平下降，而il4, il10则升高［4-6］,并初步认定ca患者在hpv感染后出现了全身性免疫受抑制现象，即th1细胞免疫功能下降，而对其皮损局部免疫功能的研究相对较少. ca常发生于肛门生殖器，而且经治疗后复发也基本局限在原发的部位的皮肤粘膜. 故可以推测，除患者全身免疫功能外，ca患者皮损处皮肤粘膜的局部免疫状态，尤其是局部的细胞免疫功能状态对其预后起着更直接的影响.
alfred等［6］研究发现，自行消退的ca患者皮损局部ifnγmrna表达增高；mark等［7］发现部分宫颈处hpv感染者其可在数月后自动消退，采用rtpcr对其宫颈局部黏膜处的细胞因子mrna进行检测证实，所有自动消退的患者消退前宫颈局部显示有th1型细胞因子ifnγ的表达，而缺乏th2型细胞因子il4的表达.
我们研究发现，ca患者皮损中有ifnγ和il4蛋白的表达增高，主要与炎症细胞尤其是淋巴细胞在皮损处的活化和大量浸润，使局部淋巴细胞相对数量增加有关. 但在不同预后的ca患者中这两种细胞因子的表达却有不同，未复发组ifnγ蛋白表达程度积分高于复发组，复发组il4蛋白表达程度积分虽高于未复发组,但其差别无统计学意义，这和arany等［8］的研究结果相符. 以上结果提示ca皮损局部不同il4蛋白表达差异对其预后无明显影响；而ifnγ蛋白表达程度增高却有利于ca的消退，ifnγ由th1亚群产生，即皮损局部为th1型免疫反应增强时有利于形成对局部hpv的有效的免疫.
