作者：李化永, 高双友, 杜志刚, 王艳玲, 宋蕊
【摘要】 目的： 探讨血管生成素2(ang2)及其受体tie2在前列腺癌组织中的表达 规律 及其在肿瘤组织发生、 发展 以及血管生成中的作用. 方法 ： 采用免疫组织化学sp染色法检测39例前列腺癌组织中ang2, tie2及cd34的蛋白表达, 根据cd34染色结果计数微血管密度(mvd). 结果： ang2, tie2的蛋白表达定位于肿瘤细胞或血管内皮细胞质及胞膜, 呈异质性分布;在 39例前列腺癌中ang2和tie2阳性表达率均为74%;且均与前列腺癌的分化程度、淋巴结转移密切的关系(p<0. 05);ang2, tie2蛋白阳性表达者的mvd分别为(42.1±5.2)和(42.3±5.1), 显著高于相应的前列腺癌组织ang2和tie2阴性病例［mvd分别为(33.7±3.3)和(33.2±2.3)］(p<0. 01). 结论： ang2, tie2在前列腺癌发生、演进过程中起着重要作用, 并与肿瘤血管生成关系密切.
【关键词】 前列腺肿瘤;血管生成素;受体蛋白酪氨酸激酶;微血管密度;血管生成
【abstract】 aim： to investigate the expression patterns of angiopoietin2(ang2)and its receptor, tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains(tie2)in the squamous cell carcinoma of the prostate and evaluate their roles in the tumor initiation, development and angiogenesis. methods： expressions of ang2, tie2 and cd34 proteins were detected immunohis to chemically in 39 cases of the differently graded squamous cell carcinoma of prostate. microvessel density(mvd)was counted according to the result of cd34 protein staining. results： ang2 and tie2 were mainly localized in the cytoplasm and plasmalemma of tumor cells and endothelial cells in an obvious heterogeneity fashion. the positive rates of both ang2 and tie2 proteins were 74%. the levels of the two proteins were significantly related to differentiation degree and lymphatic metastasis of tumor cells(p<0. 05). the mvds of the cases of ang2 and tie2 stronglypositive staining were(42.1±5.2) and (42.3±5.1)，respectively, both of which were significantly higher than those of negative staining (33.7±3.3, 33.2±2.3, p<0.01). conclusion： both ang2 and tie2 proteins might be of much importance in the carcinogenesis and progression of squamous cell carcinoma of the prostate. they might also play pivotal roles in neoangiogenesis.
【keywords】 prostate tumors; angiopoietin; receptor protein tyrosine kinase;microvessel density;angiogenesis
0 引言
人血管生成素(angiogenin, ang) 是一种存在于血清中的正常人体蛋白, 具有促进新生血管生成的作用及rna 酶活性, 在肿瘤的转移中发挥病理作用，可在肿瘤发生的不同阶段剌激新生血管的形成, 且肿瘤患者血液中ang 水平的高低与肿瘤的恶性程度密切相关 ［1］. tie2 是血管内皮特异性的酪氨酸激酶型受体, 主要表达在肺血管内皮以及卵泡、创口肉芽组织等血管内皮. 在血管发育中起重要的调节作用. cd34是所有血管内皮细胞的标记物，被定为泛血管内皮细胞标记物，对肿瘤微血管无特异性. 我们通过检测ang2，tie2和cd34在前列腺癌中的表达, 探讨它们在肿瘤发生、进展及血管生成中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 收集200602/200705本院制备的前列腺细胞癌组织石蜡标本39例，患者年龄73（61～85）岁，术前均未经放、化疗. 其中，前列腺癌根治性切除术(a～b期) 22例, 前列腺癌穿刺取材标本(c～d期) 17例, 均经病理检查确诊. 由有经验的病理医师重新观察肿瘤进行病理分级, 判断浸润深度及淋巴结转移情况. 浓缩型ang2羊抗人多克隆抗体（santa cruz公司）工作浓度1∶100;浓缩型tie2兔抗人多克隆抗体（博士德公司)工作浓度1∶150;即用型cd34小鼠抗人mab及sp试剂盒（北京中山公司）.
1.2 方法
1.2.1 标本处理 标本经中性甲醛固定, 梯度乙醇脱水, 常规石蜡包埋切片, 切片厚4 μm. 操作按sp试剂盒说明书染色步骤进行, 后经苏木精复染、封片、观察. 用已知阳性表达的胃癌标本作为阳性对照, 以pbs代替一抗作为阴性对照.
1.2.2 ang2及tie2判定标准 根据胞质染色程度和染色细胞百分比进行评分. 染色程度:基本不着色者为0分;着色淡者为1分;着色中者为2分;着色深者为3分. 染色细胞百分比:着色细胞占计数细胞<10%为0分; 11%～30%为1分; 31%～50%为2分; 51%～100%为3分, 将每张切片着色程度和着色细胞百分比得分相乘, 最后得分0～2分者为阴性, ≥3分者为阳性［1］.
1.2.3 微血管密度(mvd)判断标准 以血管内皮细胞质内出现棕黄色颗粒为cd34阳性判断标准, 参照 文献 ［2］的方法, 以瘤组织内阳性着色的单个内皮细胞或内皮细胞簇计为1个阳性血管标记, 每例观察切片1张, 避开肿瘤坏死或出血区域, 在低倍镜下选取肿瘤微血管数量(cd34阳性)最丰富区, 在该区域随机选择5个高倍视野(×400)分别计数微血管数目, 以其算数平均值作为mvd.
统计学处理：ang2及tie2的蛋白表达与临床各病理因素之间的统计学意义以及二者表达的相关性采用χ2检验;两种蛋白表达与肿瘤mvd之间的统计学意义采用t检验.
2 结果
2.1 ang2，tie2蛋白在前列腺癌中的表达特点 ang2及tie2蛋白阳性表达均呈棕黄色、棕褐色细颗粒状, 定位于肿瘤细胞或血管内皮细胞细胞质和/或细胞膜. 两种蛋白在肿瘤组织中呈异质性表达(图1，2), 即在肿瘤的不同区域表现出不同的特点, 或弥散分布, 或呈小片状、灶状分布, 染色的强度亦不一致.
2.2 ang2，tie2表达和mvd与前列腺癌临床病理因素的关系 ang2和tie2蛋白表达均与肿瘤分化程度及淋巴结转移关系密切, 但与年龄及肿瘤大小无密切关系. 免疫组化染色结果显示, cd34阳性表达部位以血管内皮细胞的胞质或胞膜为主, 在高分化前列腺癌中主要位于肿瘤间质, 实质内微血管含量相对较少；而在低分化前列腺癌组织内, 肿瘤实质与间质内微血管数目均明显增多, 且形态各异. mvd在前列腺癌的高、中、低分化组间有显著性差异, 且随恶性程度的增高而增多（表1）.
图1 ang2在前列腺癌中的阳性表达 sp ×100（略）
图2 tie2在前列腺癌中的阳性表达 sp ×200（略）
表1 前列腺癌ang2，t ie2和mvd与临床病理联系（略）
2.3 ang2, tie2蛋白表达与肿瘤mvd之间的关系 ang2或tie2阳性组mvd均显著高于阴性组(表2, p<0. 01), 表明ang2及tie2与mvd之间关系密切.
表2 ang2和tie2表达与微血管密度关系（略）
3 讨论
实体瘤的生长和扩散依赖于肿瘤组织中的血管生成［2］. 目前 已知的由肿瘤细胞分泌并诱导肿瘤血管生成的有血管内皮生长因子和血管生成素家族两类成员. angs及tie受体作为血管生成素家族的成员能特异性地作用于血管内皮组织，能引起内皮细胞的不稳定, 在肿瘤血管生成过程中起重要的促进作用. 研究 认为, ang2可能参与血管形成的早期启动阶段和激发阶段, 通过拮抗ang1稳定血管的作用, 离断血管外周细胞与内皮细胞的相互作用, 引起血管的不稳定, 使其更易接受其它促血管生成因子的刺激, 在后者的共同作用下, 引起肿瘤的血管生成, 从而促进肿瘤的生长. 研究表明，在胃癌［3］、肝癌［4］、胰腺癌［5］等多种消化系肿瘤中均可出现ang2及tie2的扩增和(或)过表达, 并与肿瘤细胞的恶性转化、浸润及转移有关.
前列腺癌的病情进展快、预后差、复发率高. nagata等［6］首次检测了ang1在前列腺癌中的表达, 认为ang1在前列腺癌中通过vegf网状结构发挥作用, 与肿瘤新生血管形成有关. 研究认为ang1作为血管稳定因子, 在体内动物模型和体外培养的肿瘤细胞中均表现为抑制肿瘤的生长和肿瘤性血管生成, 而ang2能促进肿瘤的生长和血管生成. 我们的结果显示, ang2及其受体tie2蛋白在前列腺癌中呈高表达, 并与肿瘤细胞分化程度及淋巴结转移情况有关, 提示二者在前列腺癌的发生及演进过程中可能起重要的促进作用, 可以作为判断肿瘤恶性程度的有用指标. 因取材与实验时间相差较短, 无法统计ang2及tie2与患者复发率及术后生存率是否相关, 故对于预测复发及评价预后尚有待于进一步研究.
肿瘤血管生成主要是通过源于骨髓的内皮前体细胞(cd34+)进入瘤组织后增殖、分化而实现的［7］. 我们通过cd3标记肿瘤mvd, 发现mvd计数高低与ang2和tie2蛋白表达强弱一致，证实了ang2和tie2蛋白参与前列腺癌血管生成作用. 同时, ang2或tie2阳性组mvd均显著高于阴性组, 可见ang2及tie2与mvd之间存在密切关系, 进一步提示ang2和tie2蛋白通过促进肿瘤血管生成而提高前列腺癌的恶性行为. 我们的结果显示, ang2及其受体tie2过表达与人前列腺癌分化程度、淋巴结转移及血管生成密切相关, 可以作为评价前列腺癌恶性程度和进展的有用指标.
【 参考 文献 】
［1］ ochiumi t, tanaka s, oka s, et al. clinical significance of angiopoietin2 expression at the deepest invasive tumor site of advanced colorectal carcinoma ［j］. int j oncol, 2004, 24 (3): 539-547.
［2］ 张真真. 血管生成素及其受体与肿瘤的血管生成［j ］. 国外医学·生理、病理 科学 与临床分册, 2004, 24(2):159-162.
［3］ moonw s, parkh s, yu kh, et al. expression of angiopoietin12 and their common receptor tie2 in human gastric carcinoma: implication for angiogenesis ［j］. j korean med sci，2006, 21(2): 272-278.
［4］ peng l, sun j, wangw d, et al. biological effect of ectopic expression of angiopoietin1 and2 in hepatocellular carcinoma cell line ［j］. hepatobiliary pancreat dis int, 2003, 2(1): 94-97.
［5］ durkin aj, bloomston m, yeatman tj, et al. differential expression of the tie2 receptor and its ligands in human pancreatic tumors ［j］. j am coll surg, 2004, 199(5): 724-731.
［6］ nagata j, kijima h, hatanaka h，et al. angiopoietin1 and vascular endothelial growth factor expression in human esophageal cancer［j］. int j mol med, 2002, 10(4): 423-426.
［7］卞修武. 血管生成、 治疗 性血管生成和抗血管生成［j］.第三军医大学学报, 2001, 23(3): 249-250.
