作者：夏桂枝，张国成，陈新民，洪新如
【摘要】 目的： 构建人epo基因真核表达载体并转染人脐血间充质干细胞，获得稳定表达人epo的人脐血间充质干细胞. 方法 ： 从人胎肝细胞中提取总rna，经过rtpcr方法扩增人epo全长cdna， 应用 基因重组技术将epo cdna基因亚克隆至pcdna3真核表达载体内，以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcdna3-epo构建的正确性，再将pcdna3-epo经脂质体介导转染人脐血间充质干细胞，经g418筛选后获得稳定转染epo基因的人脐血间充质干细胞，用rt-pcr，western blot和细胞免疫化学方法鉴定外源人epo基因在人脐血间充质干细胞中的表达. 结果： 酶切和测序结果均证实pcdna3-epo构建正确，rt-pcr，western blot和细胞免疫化学结果显示转染人epo基因的人脐血间充质干细胞体外能表达epo. 结论： 构建成功人epo基因真核表达载体，转染人脐血间充质干细胞后在体外可获得稳定表达.
【关键词】 细胞生成素 胎血 间质干细胞 转染
【abstract】 aim: to construct the eukaryotic expression vector of human epo gene and explore its expression in mesenchymal stem cells (mscs) derived from human umbilical cord blood (ucb). methods: the total rna was extracted from human fetal liver cells. epo cdna was obtained by rt-pcr amplication and subcloned into pcdna3 vector to construct recombinant pcdna3-epo plasmid. after identified by restriction enzyme analysis and sequencing,the pcdna3-epo was introduced into the human ucb-derived mscs mediated by lipofectamine and the expression of exogenous epo was examined by rt-pcr,western blot and immunocytochemistry. results: the recombinant pcdna3-epo was shown to meet the design by restriction enzyme analysis and sequencing. the results of rt-pcr,western blot and immunocytochemical analyses indicated that the exogenous epo successfully expressed in human ucb-derived mscs. conclusion: the recombinant pcdna3-epo with full coding sequence of human epo cdna is successfully constructed and human ucb-derived mscs with stable expression of exogenous epo are established.
【keywords】 erythropoietin；fetal blood；mesenchymal stem cells; transfection
0 引言
近年 研究 发现促红细胞生成素（erythropoietin，epo）具有神经营养、神经保护和促进神经发育的作用，在脑组织损伤尤其是新生儿缺氧缺血性脑损伤中发挥着重要作用［1］. 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，mscs）是近年发现的一种具有多向分化潜能的成体干细胞［2］，而且是外源基因良好的细胞载体［3-4］. 我们构建人epo基因真核表达载体，将其转染人脐血mscs，观察epo在人脐血mscs中的表达情况，以探索epo基因修饰的人脐血mscs用于移植 治疗 新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，hie）的可行性.
1 材料和方法
1.1 材料 人胎肝细胞系l02，质粒pcdna3由福州总 医院 实验科王水良博士惠赠. 菌种e. coli dh5α为福州总医院实验科保存. rt-pcr反转录试剂盒（promega公司）；dna胶回收试剂盒（上海华尧核酸技术有限公司）；质粒抽提纯化试剂盒（qiagen公司）；ecorⅰ，xhoⅰ限制性内切酶，dntp，taq酶，t4 dna连接酶，dna分子质量marker dl2000，dl15000（takara公司）；lipofectaminetm 2000，trizol（invitrogen公司）；mscs培养基mesenculttm（stem cell公司）；兔抗人epo抗体、hrp-羊抗兔igg，western blot化学发光试剂（santa cruz公司）；pvdf膜（pierce公司）；elivisiontm plus试剂盒（北京中杉生物技术公司）.
1.2 方法
1.2.1 epo cdna的合成 参照trizol说明书抽提人胎肝l02细胞总rna，反转录为人胎肝细胞总cdna，以反转录产物为模板，pcr法扩增epo cdna. pcr引物根据genbank中登录的epo cdna 全长序列设计两对引物. 扩增epo cdna全长序列上游引物： 5′-atgaattcatgggggtgcacgaatgtcc-3′，下划线部分为ecorⅰ酶切位点，下游引物：5′-gcctcgagtcatctgtcccctgtcctgc-3′，下划线部分为xhoⅰ酶切位点；预期扩增片段长582 bp. rt-pcr法鉴定epo在人脐血mscs中表达的上游引物为：5′-tcatctgtgacagccgagtc-3′，下游引物为：5′-cactgacggctttatccaca-3′，预期扩增片段长288 bp. 均由上海生工生物工程公司合成. pcr反应体系如下：总体积为50 μl，10×pcr缓冲液5 μl，dntp混合液4 μl，待扩增的模板（人胎肝细胞总cdna）6 μl，上游引物（20 μmol/l）0.5 μl，下游引物（20 μmol/l）0.5 μl，dna聚合酶1 μl，dd h2o 33 μl. 94℃预变性5 min，94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃ 45 s，共35个循环. 72℃延伸5 min. 取反应产物3 μl，15 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定.
1.2.2 pcdna3-epo表达载体的构建 将pcr法扩增的epo cdna和质粒pcdna3经ecorⅰ和xhoⅰ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段. t4 dna连接酶于16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌dh5α，在氨苄青霉素选择性培养基上筛选阳性克隆. 快速抽提质粒后进行酶切鉴定，将酶切鉴定正确的菌株送上海生工生物工程公司测序. pcdna3-epo重组质粒的纯化按质粒抽提纯化试剂盒说明进行.
1.2.3 人脐血mscs的分离培养 脐血标本来自于健康足月顺产新生儿，产妇产前检查均正常，脐血的收集均已征得产妇同意. 无菌条件下采集脐带血，每份30～80 ml，脐血采集后4 h内应用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞. 所得单个核细胞以1×109/l接种于mesenculttm完全培养基，置于37℃，50 ml/l co2和饱和湿度的co2培养箱中培养.5～7 d后首次换液，7～14 d后贴壁的人脐血mscs细胞克隆出现，当细胞融合达80%左右时按1∶3的比例传代.
1.2.4 pcdna3-epo重组质粒稳定转染人脐血mscs 选择p3代人脐血mscs，采用脂质体介导转染方法转染epo基因，按照lipofectaminetm 2000试剂说明书进行. 转染24 h后按1∶10接种到6孔板中，加入新鲜的完全培养基. 次日换液，加入含400 mg/l的g418的筛选培养基培养6 d，再换用含200 mg/l g418培养基培养，2 wk后阳性克隆形成，挑取单个克隆扩大培养和传代.
1.2.5 rt-pcr鉴定 抽提稳定转染pcdna3-epo的人脐血mscs总rna，经无rna酶的dna酶处理并抽提纯化后反转录为总cdna，以总cdna为模板，采用epo鉴定引物，pcr扩增epo cdna基因片段. pcr反应体系同上方法.
1.2.6 western blot 鉴定 取生长良好的稳定转染pcdna3-epo的人脐血mscs 1×107，加入ripa缓冲液（含10 g/l pmsf），冰浴后4 ℃离心取上清，用同样方法从培养的胎肝细胞系l02中抽提蛋白质. 测定蛋白浓度后进行100 g/l sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳. 电泳完毕后将蛋白转移至pvdf膜上，封闭液封闭，加入兔抗人epo多克隆抗体（1∶200）结合，洗膜后加入hrp-羊抗兔igg（1∶5000）结合，再次洗膜后加入western blot化学发光试剂，放置1 min后于暗室内用x光片进行化学发光自显影，洗片后采用图像 分析 仪扫描.
1.2.7 细胞免疫化学鉴定 将稳定转染pcdna3-epo的人脐血mscs按5×105/l接种于放置有消毒盖玻片的六孔板内，制备细胞爬片. 24 h后弃掉培养基，细胞爬片用pbs洗2次，加入40 g/l多聚甲醛固定20 min，pbs洗2次. 采用兔抗人epo多克隆抗体（1∶100），参照elivisiontm plus试剂盒说明进行细胞免疫化学染色. 实验对照组用未转染pcdna3-epo重组质粒的人脐血mscs爬片直接进行细胞免疫化学染色.
2 结果
2.1 pcdna3-epo真核表达载体的构建 用pcr法扩增epo cdna，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，出现一条特异性区带，位于分子质量标准500 bp附近，与预期大小相符（图1）. 将pcr产物克隆至真核表达载体pcdna3中，重组质粒pcdna3-epo经酶切鉴定后，结果证实所插入基因的位置、大小和方向均正确（图2）；测序结果也表明所构建的质粒符合预期设计.
2.2 外源epo基因在人脐血mscs中的表达 在288 bp处扩增得到特异性目的片段（图3），表明在转染的人脐血mscs中有特异性的epo基因的表达. western blot 鉴定结果显示，在转染了pcdna3-epo质粒的人脐血mscs中可检测到epo蛋白的表达（图4），其蛋白条带位置（34 ku）与阳性对照即人胎肝细胞l02一致，而未经转染的人脐血mscs无epo蛋白的表达.
1: epo cdna ; 2: dna marker (dl2000).
图1 epo cdna 的pcr扩增产物（略）
1：pcdna3-epo的ecorⅰ/xhoⅰ酶切； 2：pcdna3-epo的ecorⅰ酶切； 3：pcdna3的ecorⅰ/xhoⅰ酶切； 4：pcdna3的ecorⅰ酶切； 5：dna marker（dl2000）； 6：dna marker（dl15000）.
图2 重组质粒pcdna3-epo的ecorⅰ/xhoⅰ酶切鉴定（略）
1：epo cdna片段的pcr产物； 2：dna marker（dl2000）.
图3 外源epo基因在人脐血mscs表达的rt-pcr鉴定（略）
1：人胎肝细胞； 2：转染epo基因的人脐血mscs.
图4 外源epo基因在人脐血mscs表达的western blot鉴定（略）
2.3 细胞免疫化学鉴定 转染pcdna3-epo的人脐血mscs胞质呈棕褐色，为epo阳性表达；未转染pcdna3-epo的人脐血mscs不表达epo，胞质为蓝色（图5）.
a： 转染； b： 未转染.
图5 外源epo基因在人脐血mscs中表达的细胞免疫化学鉴定 dab ×200（略）
3 讨论
hie是新生儿时期的常见病， 目前 对重度新生儿hie尚缺乏特异有效的 治疗 方法 ［5］. 近年报道从新生儿脐血中亦分离到mscs，发现mscs不仅可分化成多种中胚层来源的细胞，在一定的条件下亦能分化为神经细胞［2］，移植至脑内后能明显改善受损神经系统的功能［6］. mscs不仅能向神经细胞分化，而且易于外源基因转染和表达，将外源的神经营养因子基因体外转染mscs，再移植入脑内，神经营养因子在脑内稳定表达，可以增强mscs移植治疗的效果［3-4］.
epo是一种新的、作用很强的神经营养因子，不仅可促进神经前体细胞的增殖和分化，减少神经细胞的凋亡；而且能促进血管内皮细胞的成熟和存活，使血管再生，减轻局部缺氧造成的损害［1］. 脑内的epo和epo受体的表达受低氧诱导因子的调控，在缺氧缺血条件下，epo尤其是epo受体表达明显增加［7］，因此外源的epo具有很好的治疗缺氧缺血性脑损伤的作用. 然而epo仅有极少量透过血脑屏障，并且半衰期短，只有大剂量、多次静脉注射才能取到一定的治疗效果［8］，但大剂量静脉注射易出现红细胞增多，多次注射有导致纯红再障的风险［9］，而脑内注射尤其是多次脑内注射在临床上是行不通的. 将epo基因通过移植细胞导入脑内，使其在脑内持续表达，就可以发挥epo的神经营养和神经保护作用，此即为epo的基因治疗. 而且脑内的epo不进入血循环，不会出现红细胞增多和纯红再障等不良反应.
我们选择人epo基因和人脐血mscs作为靶基因和靶细胞，将人epo基因转染人脐血mscs，获得稳定转染人epo基因的人脐血mscs，以期作为一种基因修饰干细胞用于移植治疗重度新生儿hie，起到epo基因治疗和mscs细胞治疗相结合的双重作用. 本实验成功构建出了epo基因真核表达载体，转染人脐血mscs后经稳定筛选获得了能稳定表达epo的人脐血mscs，为epo基因修饰的人脐血mscs用于移植治疗重度新生儿hie奠定了实验基础. 同时因为epo是一种具有促红细胞生成作用的造血因子，人脐血mscs尚具有支持造血的功能［10］，因此epo基因修饰的人脐血mscs还可用于临床上各种贫血的治疗，对于探索治疗贫血的新方法也具有重要的实用价值.
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