作者：郑东诞 蔡安平 李玉杰 邝健 饶绍奇 黄裕立 江志羔 宋元彬 麦炜颐
【摘要】 【目的】 探讨阿托伐他汀对急性心肌梗死大鼠心肌髓过氧化物酶(mpo)浓度、基质金属蛋白酶组织抑制因子-2/基质金属蛋白酶-9 (timp-2/mmp-9)表达的影响及其对心功能保护作用。【方法】 结扎40只雄性sd大鼠左冠状动脉造成急性心肌梗死模型，存活35只随机分为两组。假手术组10只。术后第1天起给予阿托伐他汀灌胃(1 mg/kg/d，17只)，对照组给予等量生理盐水(18只)。14 d后，比较各组大鼠心肌组织mpo浓度、胶原纤维含量、心肌梗死面积、timp-2/mmp-9表达量和心功能。【结果】 对照组大鼠心肌组织髓过氧化物酶浓度、胶原纤维含量、心肌梗死面积均明显高于阿托伐他汀治疗组(p < 0.05)，而timp-2/mmp-9比值和心功能低于阿托伐他汀治疗组(p < 0.05)。【结论】 阿托伐他汀可改善急性心梗大鼠心脏重构及心功能，主要是通过减少白细胞浸润、下调mpo浓度和调节timp-2/mmp-9表达，从而减少心肌梗死面积及胶原纤维含量。
【关键词】 急性心肌梗死; 髓过氧化物酶; 心脏重构; 心功能
abstract： 【objective】 to investigate the effects of atorvastatin on concentration of mpo and expression of timp-2/mmp-9 in left ventricle， and preservation of heart function after myocardial infarction in rat. 【methods】 acute myocardial infarction was performed by ligating left coronary artery in 40 male sprague-dawley rats. thirty-five survival rats were randomly divided into two groups. group atorvastatin was gavaged with 1 mg/kg/day atorvastatin (n = 17) and group control was gavaged with equal volume of saline (n = 18) from the first day after myocardial infarction. fourteen days later， concentration of mpo， fibrosis volume， infarcted area， expression of timp-2/mmp-9 and cardiac function were compared with control group. 【results】concentration of mpo， fibrosis volume， and infracted area were higher in control group compared with atorvastatin group (p < 0.05)， while timp-2/mmp-9 ratio and cardiac function in control group were lower compared with atorvastatin group (p < 0.05). 【conclusion】 cardiac remodeling and cardiac function were improved by atorvastatin treatment after acute myocardial infarction in rat. the main mechanism is by reducing leukocyte infiltration， down-regulation of myeloperoxidase concentration and regulation of timp-2/mmp-2 expression， which attributed to infarcted area and fibrosis volumn decrease.
急性心肌梗死(acute myocardial infarction，ami)后，大量炎症细胞(如中性粒细胞等)浸润梗死心肌组织并释放各种炎症介质(如髓过氧化物酶，myeloperoxidase，mpo)[1]，心肌组织中的mpo与中性粒细胞产生的氧自由基(如h2o2等)相互作用，产生氧化应激反应，导致内皮细胞功能受损，造成内皮细胞源性一氧化氮生成障碍，影响血管平滑肌舒张功能，从而造成局部心肌组织血流供应减少，导致心肌细胞坏死和凋亡的增加[2， 3]。wWW.11665.com心肌细胞坏死和凋亡的增加，将导致心肌组织胶原纤维增加，室壁运动减弱，造成心肌收缩和舒张功能异常[4]。同时，心肌组织中大量炎症介质也影响基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，mmp)和基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase， timp)的表达，从而影响心脏重构及心功能[5-6]。既往有研究报道，急性心梗后外周血mpo浓度高低与早期和远期心血管事件相关，可能是由于mpo在心梗边缘区激活凝血酶激活物抑制剂-1，并通过下游信号通路等导致心脏重构[3，7]。也有学者报道在急性炎症反应中mpo浓度升高可下调内皮细胞一氧化氮合酶生物活性，影响血管舒张功能及组织血流，导致组织细胞坏死及胶原纤维增生。他汀类药物具有调脂以外多效性(pleiotropic effects)，如改善血管内皮细胞功能、增加内源性一氧化氮合成、抗炎症和氧化应激、改善心脏重构等[8]。既往有文献报道他汀类药物可通过减少炎症细胞浸润及下调mpo浓度减少心肌梗死面积[9]。然而他汀类药物是否通过减少急性心梗后mpo浓度而改善timp/mmp平衡，从而起到改善急性心梗大鼠心脏重构及心功能的作用，既往未见报道。本研究拟作这方面探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级雄性sprague-dawley(sd)大鼠(8周龄，200 ～ 250 g) 50只，由中山大学动物实验中心提供(许可证号：0040844)。
1.2 急性心肌梗死动物模型制作
具体操作参考文献并加以改良[10-11]，以100 g/l水合氯醛(按体质量3 ml/kg)腹腔注射麻醉动物，固定大鼠于仰卧位，经口插管连接动物呼吸机(hx-300s动物呼吸机，成都泰盟)辅助呼吸(潮气量6 ml，呼吸频率60 次/min)，剔除心前区体毛后常规消毒，经左侧第4肋间切口逐层分离皮下组织，分离心包，暴露心脏，找到左冠状动脉，于左心耳下缘1 mm处以6-0无菌线完全结扎左冠状动脉，观察心电记录仪(心电记录系统sp2006，北京吉安得尔科技有限公司)胸前导联st段弓背向上抬高，直视下见左心室变苍白为心肌梗死模型制作成功(手术组40只);假手术组(group sham)10只仅在相应部位穿线但不结扎。
1.3 实验分组
心梗后存活35只sd大鼠随即分为两组，阿托伐他汀治疗组(group ator) 17只于术后第1天开始进行阿托伐他汀灌胃[1 mg/(kg·d)，参考文献[12]];对照组(group control) 18只和假手术组(sham group) 10只予等量生理盐水灌胃，共14 d。
1.4 心功能评价
多普勒心脏彩超(atl-hdi5000， 10 mhz探头)评估sd大鼠心功能，采用盲法检测ami后第1天和第14天3组大鼠ef(ejection fraction)、fs(fraction shortening)、lvds/lvdd(left ventricular systolic/diastolic dimension)值，具体操作参考文献[13]。
1.5 左心室质量指数
心功能检测结束后，迅速将大鼠心脏取出置于生理盐水中，清除心腔残留血液后滤纸吸干，称取全心质量，沿房室环及室间沟分离左心室称质量，左心室质量指数(lvmi) = 左心室质量/体质量(mg/g)。
1.6 心肌组织各项指标检测
将左心室分为三部分，将心尖部置于40 g/l多聚甲醛溶液中，用于形态学检测(he染和masson染色);中间部分置于1% ttc染液中用于心肌梗死面积检测，梗死面积 = 梗死面积/左心室总面积 × 100%;心底部置于-80 ℃液氮中，用于组织mpo和timp-2、mmp-9检测。mpo检测试剂盒购于南京建成科技有限公司。每个中性粒细胞中含有恒定mpo(约占细胞干质量5%)，mpo能还原过氧化氢，因此利用mpo这个特性可分析酶活力，并定量测定中性粒细胞数目。将心肌组织匀浆后逐步加入预先配好mpo试剂，置于37 ℃水浴15 min 后取出，加入显色剂混匀，60 ℃水浴10 min，取出后立即在460 nm处(分光光度计-722，上海晓光仪器有限公司)，1 cm光径下，蒸馏水调零，测定个管吸光度值。每100 mg组织中mpo浓度单位计算方法为：(测定管od值-对照组od值)/(11.3 × 100 mg)。
1.7 心肌组织timp-2和mmp-9检测
取各组心肌组织100 mg提取蛋白，用western-blotting 检测心肌组织timp-2和mmp-9表达。一抗分别为小鼠抗大鼠timp-2 (1：500)和兔抗大鼠mmp-9(1：250)，均购自abcam公司。蛋白经电泳及转膜，被检测膜经洗涤及牛奶封闭后，加一抗于4 ℃孵育过夜;检测timp-2和mmp-9的二抗分别为羊抗小鼠1：3 000和羊抗兔1：4 000，二抗均购自santa cruz。内参为β-actin，小鼠抗大鼠一抗1：250 和羊抗小鼠二抗1：6 000(均购自santa cruz)。
1.8 统计学分析
实验数据用均数 ± 标准差表示，用spss 13.0软件进行分析统计。组间差异采用one-way anova或?字2检验进行分析，检验水准α = 0.05。
2 结 果
ami后第1天各组随机取5只大鼠进行心功能、组织学和mpo浓度检测。心梗第14天时，阿托伐他汀治疗组、对照组和假手术组分别有9只(死亡3只)、7只(死亡6只)和 5只大鼠存活。存活大鼠进行心功能、组织学、mpo浓度和timp-2/mmp-9测定。
2.1 3组动物心功能比较
心梗组大鼠术后心功能与假手术组相比均明显降低(p < 0.05)，说明心梗模型构建成功;ami后第1天，心梗组大鼠心脏超声检测lvef、fs、lvds和lvdd，两组间无明显差别;ami后第14天，对照组大鼠心功能与阿托伐他汀治疗组相比明显下降，两组间差别具有统计学意义(p < 0.05);对照组大鼠术后第14天心功能与术后第1天相比进一步减低，差别具有统计学意义(p < 0.05)，而阿托伐他汀治疗组术后第14天与第1天相比稍有升高，但差别无统计学意义(p = 0.0763，表1)。
2.2 组织学检测
分别取心梗后第1和14天各组大鼠心肌组织进行he和masson染色。随机检测10个高倍视野，计算浸润的白细胞数及胶原面积。由图1可见心梗后第1天，对照组和阿托伐他汀治疗组间心肌梗死边缘区炎症细胞浸润程度相似，胶原纤维含量3组间无明显差别;心梗后第14天，对照组梗死边缘区仍有较多炎症细胞浸润，且胶原纤维增生较阿托伐他汀治疗组明显;而阿托伐他汀治疗组炎症细胞浸润程度较心梗后第1天减轻。见表2。
2.3 左心室重量指数及心肌梗死面积
心梗后14 d，对照组大鼠左心室重量、左室重量指数和心肌梗死面积均明显增加，与阿托伐他汀治疗组相比，差别具有统计学意义(p < 0.05，表3，图2)。
2.4 心肌组织mpo浓度
心梗后第1天，对照组和阿托伐他汀治疗组间mpo浓度无明显差别，心梗后第14天，对照组mpo浓度明显高于阿托伐他汀治疗组，两组间差别具有统计学意义(p < 0.05);而假手术组mpo升高不明显(表4)。
2.5 心肌组织timp-2和mmp-9表达
心梗后第14天，对照组和阿托伐他汀治疗组mmp-9表达量高于假手术组，2组间无显著差别;阿托伐他汀治疗组timp-2表达量较对照组升高;对照组timp-2/mmp-9比值明显低于阿托伐他汀组和假手术组(分别为0.12 ± 0.05，0.65 ± 0.13， 和 0.92 ± 0.08，图3、4)。
3 讨 论
心肌梗死后炎症反应在早期心脏破裂及晚期心脏重构中起重要的作用[3，14-15]。心梗后中性粒细胞浸润并释放mpo到胞外，直接对心肌细胞及血管内皮细胞产生毒性作用[16]。内皮细胞功能受损导致内皮细胞源性一氧化氮合成的减少，从而影响心肌组织timp和mmp的表达。mmp是一类锌、钙依赖性的蛋白水解酶家族，与timp一起调节细胞外基质的合成与降解[16]。mmp的正常表达及timp/mmp比例平衡是维持心肌胶原纤维、心脏结构正常的重要因素。
本研究发现，心梗后第1天心梗组大鼠心肌梗死边缘区炎症细胞浸润程度无明显差别，但14天后对照组心肌组织炎症细胞浸润程度和mpo浓度仍较高，而阿托伐他汀组炎症反应程度较心梗后第1天降低;且对照组胶原纤维含量在心梗第14天时也明显增加。既往有文献报道[17]，他汀类药物可以改善心梗大鼠心肌组织微环境，主要是通过减少炎症因子表达及炎症细胞浸润，调节内皮祖细胞迁移，增加内源性一氧化氮合成和释放。因此，我们认为本研究阿托伐他汀可能也是通过上述机制增加心肌组织血供、减少炎症细胞与内皮细胞粘附从而下调组织mpo浓度和改善心脏重构。阿托伐他汀治疗组心梗第14天心功能与第1天相比差别虽无统计学意义，但仍呈增高趋势;而在对照组则进一步减低。我们认为这可能与对照组大鼠心梗14 d后心肌组织仍有大量炎症细胞浸润、timp-2/mmp-9表达失调，造成胶原纤维明显增生，加重心脏重构，从而影响大鼠收缩舒张功能。对照组大鼠左心室重量指数以及心肌梗死面积的增加也提示心肌炎症反应程度与心功能及心脏重构明显相关。而阿托伐他汀治疗组大鼠虽然心功能无明显改善，但由于心肌组织炎症反应及心脏重构的改善，对大鼠心功能可能起一定保护作用。既往有文献报道[17]他汀类药物可通过其多效性提高大鼠心功能，但本研究阿托伐他汀治疗组大鼠心功能与术后第1天相比并无显著提高，我们认为这种差异可能是由于本研究阿托伐他汀给药时间较短以及给药剂量较小有关。
本研究发现虽然心梗后对照组心肌组织中mmp-9上调表达量和阿托伐他汀治疗组相似，但timp-2表达在对照组下调更明显，造成对照组大鼠心肌组织中timp-2/mmp-9比值失调也更明显(0.12 ± 0.05 vs 0.65 ± 0.13，p < 0.05)。正常生理情况下，timp以非共价键1 ∶ 1与mmp活性区高度结合，从而可以降低mmp与胶原底物的结合，抑制mmp的活性[16]。但在炎症反应如急性心肌梗死等情况下，心肌组织内产生大量炎症介质，引起心梗后mmp表达的上调和活性过度增强，timp/mmp比例失调，导致正常的心肌胶原蛋白过度降解，同时心肌组织被缺乏连接结构的胶原纤维化所取代。既往有研究报道[5]他汀类药物可通过mmp依赖性和非mmp依赖性途径调节心肌成纤维细胞增殖。本研究发现心梗14 d后，阿托伐他汀治疗组胶原纤维含量较对照组明显减少，我们认为阿托伐他汀可能是通过调节心肌成纤维细胞增殖而减少心脏胶原纤维含量。也有文献报道[18]心梗后tnf-α等炎症因子的浸润也将导致timp等表达下调，导致心脏重构。虽然本研究未检测心肌组织tnf-α表达，但结合既往文献报道[19]阿托伐他汀可下调炎症因子如tnf-α、白细胞介素-1等表达，我们认为阿托伐他汀也可能通过上述机制改善心肌组织timp-2/mmp-9比例，从而改善心脏重构。结合本研究超声检测结果阿托伐他汀治疗组左室收缩末和舒张末心室腔较对照组减小，均提示阿托伐他汀可减轻心脏重构。
因此，我们认为阿托伐他汀可改善急性心梗大鼠心脏重构，同时具有较好心功能保护作用，主要是通过减少心肌组织炎症细胞浸润、下调mpo浓度和改善心肌组织timp-2/mmp-9表达，从而减少心肌梗死面积和胶原纤维含量。
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