【摘要】 研究了厚朴酚与和厚朴酚及其混合溶液的二阶导数同步荧光光谱，结果两者的二阶导数同步荧光光谱得到完全分离，消除了彼此间的干扰，据此建立了一种二阶导数同步荧光光谱法同时直接测定混合物中厚朴酚与和厚朴酚的新方法。厚朴酚与和厚朴酚的线性范围分别为2.8～500.0 μg/l和4.3～560.0 μg/l；检出限分别为0.84和1.30 μg/l，回收率分别为94.65%～105.58%和95.09%～104.51%; 相对标准偏差均低于4.08%。本方法用于同时直接测定厚朴药材及其提取物中厚朴酚与和厚朴酚含量，结果令人满意。
【关键词】 二阶导数同步荧光光谱 厚朴酚 和厚朴酚 厚朴
1 引言
厚朴酚(magnolol, mol)与和厚朴酚(honokiol, hol)为同分异构体属联苯酚类化合物，有较强的荧光，具有抗肿瘤、抗菌、镇痛等多种药理活性，是我国常用传统中药厚朴(magnolia officinalis)的有效成分和质量控制指标。目前全国采用厚朴配方的中西成药及日化产品多达300余种[1，2]。厚朴酚与和厚朴酚的检测方法有高效液相色谱法(hplc)[3]、荧光光度法[4～6]、同步荧光法[7]和紫外光度法[8]。hplc法两者分离度好，可同时直接测定，但操作繁琐、耗时长、成本较高；而采用荧光光谱、同步荧光光谱、紫外吸收光谱时，原朴酚与和原扑酚的光谱相互重叠不能同时直接测定，需解联立方程式或用校正算法进行间接测定，计算复杂，且样品前处理需加入表面活性剂、缓冲溶液等较为繁杂，难以普及推广。www.11665.CoM
同分异构体的测定一直是分析工作中的难点和热点，用常规光谱分析方法很难达到分别测定的目的。本研究利用二阶导数同步荧光光谱法对厚朴酚与和厚朴酚及其混合溶液进行荧光光谱分析，有效地分离了相互重叠的荧光峰，提高了检测的选择性和灵敏度，据此建立了二阶导数同步荧光光谱法同时直接测定混合物中厚朴酚与和厚朴酚的新方法。与现有光谱法比较，本方法厚朴酚与和厚朴酚分离度好，分辨率高，样品前处理简单，有机溶剂用量少，计算容易，便于普及推广；与药典hplc法相比，两种方法测定结果有良好的一致性，但本法更简单快捷、成本较低。
2 实验部分
2.1 仪器与材料
f2500型荧光分光光度计(日本日立公司)，hp1100高效液相色谱仪(美国惠普公司)。厚朴酚及和厚朴酚标准品(中国药品生物制品检定所)，厚朴药材(购于贵阳市花果园药材市场)粉碎过０．３０ mm孔径筛，厚朴超临界流体萃取物(自制)；甲醇、冰乙酸、乙酸钠为分析纯，实验用水为去离子水。
2.2 标准品及样品制备
标准品制备：称取一定量的和厚朴酚、厚朴酚标准品用甲醇溶解，分别配制成280、250 mg/l的标准贮备液；分别取和厚朴酚、厚朴酚标准贮备液2、4、6、8、10 μl置于5 ml比色管中，加水定容至刻度，摇匀，配制成系列标准工作溶液。样品制备：取厚朴粉0.2 g置具塞锥形瓶中，加入甲醇25 ml，称定重量，超声提取40 rnin，补足损失溶剂，摇匀，过滤，取滤液10 μl按标准工作溶液制备方法处理得到待测样品溶液；将厚朴萃取物10 mg用甲醇溶解定容于25 ml容量瓶中，取定容后的样品液10 μl按标准工作溶液制备方法处理得到待测样品溶液。
2.3 实验方法
用1 cm石英荧光池，设置δλ=110 nm，激发、发射通带10 nm，扫描速度1500 nm/min，在240～350 nm范围内对样品进行同步荧光光谱扫描，并作二阶导数处理。
3 结果与讨论
3.1 荧光光谱
分别对和厚朴酚、厚朴酚标准工作溶液及其混合溶液进行荧光光谱扫描，测得它们的最大激发波长均为285 nm；和厚朴酚、厚朴酚最大发射波长分别为347和405 nm，由图1可知两者荧光光谱都具有宽带结构，相互重叠彼此干扰，用常规荧光法难以同时直接测定。
3.2 导数同步荧光光谱
应用导数同步荧光法测定组分，最重要的参数是δλ的选择，它直接影响方法的灵敏度与选择性。每隔10 nm，分别考察了δλ=0～160 nm波长范围内和厚朴酚、厚朴酚标准工作溶液及其混合溶液的同步荧光光谱，结果表明δλ=110 nm时两者的荧光光谱分辨率最好，结果如图2所示。
图1 和厚朴酚、厚朴酚及二者混合物的荧光光谱（略）
fig.1 fluorescence spectra of honokiol(hol), magnolol(mol) and their mixture
1． hol 224 μg/l； 2． mol 200 μg/l； 3． hol+mol.
图2 和厚朴酚、厚朴酚及二者混合物的同步荧光光谱（略）
fig.2 synchronous fluorescence spectra of hol,mol and their mixture
1． hol 224 μg/l； 2． mol 200 μg/l； 3． hol+mol. δλ＝１１０ nm。
由图2可知相对于常规荧光光谱，两者的同步荧光光谱谱带宽度变窄，相互重叠的荧光峰得到了一定的分离，但荧光峰仍重叠较多干扰严重。经二阶导数处理后，两者的导数同步荧光光谱达到完全分离，结果如图3所示。
3.3 甲醇用量的影响
厚朴酚在乙醇中具有自猝灭特性[9]。分别考察了不同甲醇用量对和厚朴酚与厚朴酚混合溶液二阶导数同步荧光光谱的影响。图4b结果表明和厚朴酚d2f/dλ2随体系甲醇浓度增加而增大。当体系甲醇浓度≥50%则逐渐下降；图4a结果表明厚朴酚d2f/dλ2在体系甲醇浓度≤80%时较稳定; 而当体系甲醇浓度≥90%时即发生荧光自猝灭。本实验选用≤10%甲醇为测试体系，虽然牺牲了一定的和厚朴酚的测定灵敏度，但可减少甲醇的挥发，且价廉、环保。
图3 和厚朴酚、厚朴酚及二者混合物的二阶导数同步荧光光谱（略）
fig.3 ｓecond order derivative synchronous fluorescence spectrum of hol, mol and their mixture
1． hol 224 μg/l； 2． mol 200 μg/l； 3． hol+mol．
图4 甲醇用量对厚朴酚（a）及和厚朴酚(b)二阶导数值的影响（略）
fig.4 ｅffect of methanol content on d2f/dλ2 of mol (a) and hol (b)
hol 224 μg/l, mol 200 μg/l.
3.4 酸度的影响
厚朴酚与和厚朴酚分子内均含2个酚羟基，但二者光酸性不同。当ph＜4.0时，由于质子猝灭导致厚朴酚与和厚朴酚的荧光效率降低[5]。向和厚朴酚与厚朴酚混合溶液中分别加入醋酸醋酸钠缓冲液(ph=4.5) 0～5 ml，用水定容至5 ml，观察两者二阶导数同步荧光光谱的光酸性变化。
图5 缓冲液体积对厚朴酚（a）及和厚朴酚(b)二阶导数值的影响（略）
fig.5 effect of hacnaac(ph=4.5) volume on d2f/dλ2 of ｍｏｌ(a) and hol(b)
hol 224 μg/l; mol 200 μg/l.
由图５b可见，和厚朴酚d2f/dλ2随缓冲液体积增加而逐渐降低，表明酸性介质对其有猝灭作用；由图5a可见，当缓冲液体积为4 ml时厚朴酚d2f/dλ2最大，表明酸性介质对其有增敏作用。本实验选用水为稀释剂，虽然牺牲了一定的厚朴酚的测定灵敏度，但经济、操作便利。
3.5 工作曲线、检出限和回收率
如图3所示，分别选取254与286 nm，采用峰零法按实验步骤绘制和厚朴酚、厚朴酚的工作曲线；以0.2%甲醇溶液为空白溶液按实验步骤在相同条件下平行测定11次，以10σ/k计算和厚朴酚、厚朴酚的定量下限，以3σ/k计算和厚朴酚、厚朴酚的检出限，结果见表1。以标准加入法6次平行测定厚朴样品中和厚朴酚回收率为95.09%～104.51%；rsd为3.93%；厚朴酚回收率为94.65%～105.58%；rsd为4.08%，准确性较好，符合分析要求。
表1 线性范围及检出限（略）
table 1 related parameters of calibration graphs and detection limits
3.6 样品分析
按实验方法同时直接测定了几种厚朴样品中和厚朴酚、厚朴酚的含量，并将测定结果与中国药典hplc法[1]测定结果相比较，表2结果表明相对偏差都在痕量分析的允许范围之内，具有较好的重现性和可靠性。
表2 与hplc法测定结果的比较（略）
table 2 comparisons of results for the determination of hol and mol by derivative synchronous fluorimetry and hplc
【参考文献】
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