【摘要】 研究了分散液液微萃取（dllme）数码比色（dc）法测定水样中的亚硝酸根。在酸性介质中，亚硝酸根和对硝基苯胺及二苯胺作用，生成红色偶氮化合物。用乙醇作分散剂，以四氯化碳为萃取剂进行分散液液微萃取，萃取液点样在薄层硅胶板上用数码相机进行数码成像。成像斑点的灰度值和亚硝酸根的浓度成正比，据此建立了测定水样中痕量亚硝酸根的新方法。对影响萃取富集效率和数码成像效果的因素进行了优化。亚硝酸根浓度在2.0～80 μg/l范围内有良好的线性关系（r=0.9997）；检出限为0.22 μg/l。方法已应用于实际水样及人体体液分析，加标回收率在97.6%～103.4%之间，相对标准偏差在1.7%～3.4%之间；方法具有仪器成本低、方便快速、灵敏度高、环境友好等特点，可满足野外现场的检测要求。
【关键词】 分散液液微萃取 数码比色 亚硝酸根 分离富集 水样
1 引言
亚硝酸根（no－２）广泛存在于土壤、地表水、食物中。它是生物体内氮循环的重要中间体，在人体内可转化成强致癌物亚硝胺[1]，是水质分析的重要指标之一。建立准确、快速，特别是能用于野外现场操作的ｎｏ－２测定方法有重要意义。
ｎｏ－２的测定主要有分光光度法[2]、荧光法[3,4]、原子吸收法[5]、液相色谱法[6]、离子色谱法[7]、毛细管电泳[8]及循环伏安法[9]等。WWW.11665.cOm光度法所需仪器简单，操作简便，但它的灵敏度不佳。其它方法则需要昂贵的仪器和复杂的样品前处理过程。分散液液微萃取(dispersive liquidliquid microextraction，dllme)是2006年由assadi[10]等提出的一种新型少溶剂的样品前处理技术。微量萃取剂在分散溶剂的作用下，在样品溶液中形成无数微小液滴。由于萃取剂用量少且与水相接触面积很大，所以可以达到很高的萃取效率和富集倍数。本方法集分离和富集于一体，操作简便快速、环境友好。目前dllme主要应用于测定有机物和重金属离子[11,12]，还未见用于测定无机阴离子的报道。
对萃取富集后的浓缩液进行检测多采用色谱法[11]和原子吸收法[12]等。这些方法的仪器价格较高、笨重，不能进行现场检测，运行费用高。数码比色检测法在2007年由杨传孝[13]等首次提出。该方法使用普通数码相机拍摄显色后试液的影像，由软件读出影像灰度积分值并计算试液浓度。整个检测系统便携、价廉，适合现场快速分析。本实验提出了新的固体基质数码比色技术，克服了原方法存在的样品体积大、灵敏度低等缺点。并用于微萃取后试液的检测。
在酸性介质中，ｎｏ－２和对硝基苯胺及二苯胺作用，生成疏水性红色偶氮化合物，易被有机溶剂萃取。本实验应用dllme与数码比色联用建立了测定痕量ｎｏ－２的新方法，并应用于环境水样和人体体液的分析。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
802型离心机（江苏金坛富华电器厂）；dimage z6数码相机（日本柯尼卡美能达公司）；5 μl微量进样器（上海安亭微量进样器厂）。ｎｏ－２标准溶液：用nano2配制成浓度为1000 mg/l no－2储备溶液，加入1滴三氯甲烷，4 ℃保存，使用前稀释至100 μg/l为工作溶液； 0.2%（m/v）对硝基苯胺乙醇溶液； 0.2%（m/v）二苯胺乙醇溶液； 4.0 mol/l ｈ２ｓｏ４； 四氯化碳； 5 cm×10 cm硅胶g薄层板（青岛海洋化工厂）， 试剂均为分析纯（上海国药集团）， 实验用水为石英二次亚沸水。
2.2 实验方法
在10 ml具塞玻璃离心管中加入10.0 ml no－2标准溶液或样品（条件实验中no－2浓度为50 μg/l），0.5 ml ｈ２ｓｏ４，0.5 ml对硝基苯胺乙醇溶液，摇匀，放置1 min。加入0.8 ml二苯胺乙醇溶液，摇匀，静置10 min。加入50 μl四氯化碳，振荡1 min，使管内形成均匀的乳浊液体系，以3000 r/min转速离心2 min，有机相沉积在管底。用微量进样器吸取5.0 μl有机相点样在硅胶薄层板上，挥干溶剂后用数码相机自动模式拍摄。用acdsee7.0软件将数码照片转化为tiff灰度格式，用scion image软件读数，得到样点灰度峰面积数据，作峰面积浓度工作曲线，或通过工作曲线计算no－2的浓度。
3 结果与讨论
3.1 分散液液微萃取
3.1.1 萃取剂的选择及用量 萃取剂的种类对萃取效率有重要影响。萃取剂应具备密度比水大，对分析物有良好的亲合性，适当的挥发性等特点。考察了二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、溴乙烷和溴苯等萃取剂，用萃取成像后的灰度值峰面积作为指标[13]来评价它们的萃取效率。结果表明，溴乙烷由于挥发性和溶解损失过大，萃取后有机相消失；其它萃取剂中四氯化碳的灰度值最大，故选择四氯化碳为萃取剂。为优化其用量，分别加入25、50、100、150和200 μl四氯化碳进行萃取。结果表明，灰度值随其用量的增加而降低，考虑到萃取后取样的方便，实验选择使用50 μl四氯化碳萃取。萃取后有机相体积为32 μl，方法的富集倍数为313倍。
3.1.2 分散剂的选择及用量 分散剂的极性应介于水和有机相之间。考察了甲醇、乙醇、乙腈和丙酮等分散剂，结果表明，这些溶剂对四氯化碳在水中均有良好的分散效果。考虑到溶剂的毒性和价格，实验选择乙醇为分散剂。实验表明乙醇的用量在1.0～1.8 ml之间对灰度值无显著影响，且反应试剂能溶于乙醇中。实验选用乙醇做为反应试剂的溶剂，乙醇总用量为1.3 ml。
3.1.3 酸度和试剂用量的影响 反应需在酸性环境下进行。考察了ｈ３ｐｏ４、ｈ２ｓｏ４、ｈｃl和乙酸等反应介质对萃取效率的影响。结果表明，在同等浓度下，h2so4介质的萃取效率最高。固定no－2的浓度为50 μg/l，采用单变量法，分别加入0.1、0.3、0.5、0.8、1.0及1.5 ml h2so4、对硝基苯胺和二苯胺，按实验方法考察其萃取效率，结果如图1。实验选用加入0.5 ml h2so4、0.5 ml对硝基苯胺和0.8 ml二苯胺。
3.1.4 放置时间和萃取时间的影响 考察了不同放置时间的影响。结果表明，萃取率随放置时间增加而增大，放置10 min后增大趋势减缓。考虑到测定速度，实验采用放置10 min。萃取时间是指将萃取剂注入体系后的振荡时间。
图1 试剂用量对萃取率的影响（略）
fig.1 effect of reagent dosage on the extraction efficiency
1. h2so4；2. 对硝基苯胺(pnitroaniline)；3. 二苯胺(diphenylamine)。
按实验方法分别振荡1～10 min考察萃取效率，结果表明，萃取时间对萃取率并无显著影响，也说明了本方法可以很快的达到萃取平衡。实验采用萃取时间为1 min。
3.1.5 盐效应 在体系中加入适量的盐能降低分析物在水相中的溶解度，提高萃取效率。在体系中加入不同质量的固体nacl进行实验，结果表明，加入盐对萃取效率并无影响，这是由于加入盐后萃取剂的溶解量下降，降低了富集倍数。实验选择不加盐。
3.2 数码比色
3.2.1 固体比色基质的选择 点样的背景灰度值（空白值）是影响数码比色结果准确度、灵敏度的重要因素。固体基质应具有灰度背景低、表面平整均匀、易吸收液体、化学稳定性好等特点。按实验方法对比了商品硅胶薄层板、自制硅胶薄层板和滤纸等固体基质的比色效果。滤纸的灰度背景不均匀，且点样后斑点扩散较大，不易积分；自制硅胶板的重现性不佳；商品硅胶薄层板的背景低且均匀，基线平滑，斑点大小合适。实验选择商品硅胶薄层板（青岛海洋化工厂）为比色基质。
3.2.2 点样体积 考察了2～10 μl点样体积对灰度值的影响。结果表明，斑点的灰度值和点样体积成正比。但点样体积增加导致斑点面积增加，加大了积分误差。综合考虑，选择5.0 μl为点样体积。
3.2.3 拍摄条件的影响 考察了不同拍摄模式对数码成像结果的影响。结果表明，各种拍摄模式（自动、光圈优先、快门优先、程序暴光）对样点和背景的灰度值无影响，实验选用自动模式进行拍摄。在靠窗位置，让自然光均匀散布在硅胶板表面，避免日光直射，能获得良好的结果。
3.3 干扰离子的影响
实验了常见离子对10 μg/l no－2测定的干扰，相对误差在±5%以内时：大量的（10000倍以上）cl－、so２－4、co２－3、na+、k+、nh＋4，5000倍的po３－4、ac－、f－、ca2+、mg2+、al3+、zn2+、co2+、ni2+、cd2+，1000倍的no－3、i－、br－、cu2+、ba2+、ag+、cr3+、hg2+不干扰测定，50倍的fe3+对测定有干扰。加入0.1 g/l 的酒石酸钠可使fe3+的允许量提高至500倍。可见本法对no－2的测定有良好的选择性。
图２ 标准溶液数码成像图和灰度曲线图（略）
fig．2 digital imaging feature of no－２ standard solution and gray scale curve
ｎｏ－２浓度(concentration of nitrite, μg/l): 1. 2； 2. 10； 3. 20； 4. 30； 5. 40； 6. 60； 7. 80。
3.4 标准曲线及检出限
在优化的实验条件下，对系列浓度的no－2标准溶液进行萃取数码比色测定。图2是系列标准溶液萃取后在硅胶板上点样后的数码成像图和经acdsee7. 0和scion image软件处理后的灰度曲线图。no－2的浓度在2.0～80 μg/l范围内与灰度峰面积呈线性关系，线性回归方程为y= 410.4+106.8c(c为no－2浓度，单位：μg/l)，相关系数r=0.9997；检出限为（s/n=3）0.22 μg/l。分别对10和50 μg/l no－2标准溶液平行测定11次，结果的相对标准偏差rsd分别为2.0%和2.6%。
3.5 样品测定
将水样和人体尿液、唾液以3000 r/min转速离心5 min，取上层清液10.0 ml或经适当稀释后按实验方法进行测定，并做两个浓度水平的加标回收实验，结果见表1。
表1 样品测定结果（n=6）（略）
table 1 analytical results of samples (n=6)
*适当稀释测定(appropriate dilution performed before analysis)
结果表明，用分散液液微萃取数码比色法测定环境及生物样品中的ｎｏ－２。样品的分离和富集可以同步进行，富集倍数高。固体基质数码比色法只需点样微量试液，可与微萃取方法很好的联用。标准系列和样品测定可在同一块薄层板上进行成像，能够消除由于拍摄环境差异带来的误差。方法简便快速、灵敏度高、环境友好，仪器设备可随身携带，能够满足野外现场测定要求。
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