【摘要】 目的：探讨桔皮素对人肝癌细胞株smmc7721的抑制作用。方法：采用四唑盐（mtt）比色法观察不同浓度桔皮素对人肝癌细胞株smmc7721细胞增殖的影响，计算半数抑制浓度ic50；绘制细胞株smmc7721的生长曲线观察桔皮素对其增殖的影响。结果：mtt结果显示不同浓度的桔皮素对smmc7721的生长均有一定的抑制作用，同一时间，各浓度组与对照组相比均有统计学差异（p<0.05）；桔皮素浓度为0.24-30μg·ml-1时，对smmc7721细胞在药物处理72小时后抑制率为3.85%～93.59%，且72小时的ic50为14.6921.11μg·ml-1。生长曲线结果提示，桔皮素对smmc7721细胞的抑制作用呈明显时效和量效关系。结论：桔皮素能抑制人肝癌细胞株smmc7721的增殖。
【关键词】 桔皮素；smmc7721；抑制增殖
芸香科植物橘是我国的一种传统中药材,其成熟果皮称陈皮、种子称橘核、幼果或幼果皮称青皮,中、内果皮间的维管束群称橘络,均以理气和胃、化痰降逆入方剂;橘的幼果称枳实,不成熟的青果横切两半称枳壳,具有破气消积、化痰消痞之功效。[1]。随着柑橘综合利用的深入开展和新技术的应用,柑橘果实中具有抗现代疾病,尤其是抗肿瘤的功效成分逐步被提取和分离出来，在用柑橘类果实的提取成分对不同疾病作用的研究中,经统计发现,柑橘果实提取的混合物中,黄酮类化合物(flavonoids)、类胡萝卜素(carotenoid)和柠檬苦素类(limonoids)具有抗癌活性功效[2]，主要抗肿瘤有效成分分为柠檬苦素类似物，多甲氧基黄酮。www.11665.com
柠檬苦素类似物是一种三萜烯类化合物，主要包括三种物质即柠檬苦素（linmonoid）,诺米林（nomilin）和黄柏酮(obacunone)，证实具有较强抗口腔癌，喉癌，肺癌，胃癌，皮肤癌肝癌，乳腺癌的作用，还能抑制结肠癌，白血病等。
体外实验证明柑橘黄酮类化合物对人非小细胞肺癌a549[3]，产黑色素的鼠黑色素细胞瘤b16，黑色素瘤4a5，人类t细胞淋巴瘤ccfhsb2，人胃癌淋巴结转移细胞tgbciitkb有很强的增殖抑制作用，而对正常人类细胞系仅有较弱的抗增殖活性[4]。多甲氧基黄酮主要包括川陈皮素和桔皮素两种。已经证实桔皮素在体外对人乳腺癌，结肠癌，肺癌细胞等有较强的抑制增殖作用[5,6,7]。本研究的目的在于在细胞水平观察并证实桔皮素对人肝癌smmc7721细胞的抑制作用。
1 材料与方法
1.1 材料 细胞株：选用人肝癌smmc7721细胞由本实验室冻存；药物：桔皮素:由四川大学药理教研室提供，以二甲基亚砜（dmso，国产分析纯）配制成30mg·ml-1的原药储存液，-20℃保存，临用时以rpmi1640完全培养基稀释；试剂：rpmi1640培养基（美国gibco公司）；青霉素，链霉素(华北制药有限公司)；优级新生牛血清(兰州中美合资民海生物公司，生产批号20060509)；四甲基偶氮唑盐（mtt）（sigma公司）；胰蛋白酶(美国gibco公司)；台盼蓝（美国sigma公司）；dmso（国产分析纯，成都科龙化工试剂厂）；仪器：超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),二氧化碳培养箱(日本san yo公司),倒置相差显微镜(德国olympus公司),全自动酶标仪(德国bio2 rad,model 1550),细胞培养板及血球计数板。
1.2实验方法
1.2.1 mtt测定取对数生长期细胞，rpmi1640培养液悬浮并调整浓度为3×104个/ml,每孔100μl,即每孔3×103个细胞接种在96孔板中，5%co2，饱和湿度37℃培养。待24小时后细胞完全贴壁，实验组加入rpmi1640完全培养基稀释的桔皮素至终浓度分别为0.24，0.47,0.94,1.88,3.75,7.50,15.00,30.00μg·ml-1,阴性对照组再加入完全培养基，溶剂对照组加入与各剂量组相对应dmso浓度的完全培养基，最高dmso浓度为0.1%（一般认为dmso≤0.1%时不引起细胞的生物学性状的改变），每孔终体积为200μl。培养72小时后，每孔再加入5mg·ml-1的mtt储存液20μl/孔，继续于5%co2，饱和湿度37℃孵箱中孵育4小时后终止实验。小心吸弃每孔上清液，并加入二甲基亚砜（dmso）100μl/孔。于10分钟内振荡混匀在酶标仪上室温于490nm波长处测定各孔的od值，重复实验3次，按公式：gi（生长抑制率）=1（药物组od值/对照组od值）×100%计算各组的生长抑制率。用ndst软件bliss法计算ic50值。
1.2.2生长曲线的测定取对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，用含10%小牛血清的rpmi1640培养液悬浮调整浓度为1.0×104个/ml,接种于24孔培养板中，每孔体积0.5ml。置于孵育箱，在37℃，5%co2及95%空气湿度条件下培养。待24h细胞贴壁后，加入各剂量的药物。分为5组：阴性对照组,阳性对照阿霉素50μg·ml-1组,桔皮素30、15、7.5μg·ml-1剂量组。每组设3个复孔,每次计数每组取3孔,每孔计数4次,取平均值。分别于加药后1d、2d、3d、4d、5d对细胞进行台盼蓝计数,最后以细胞数为纵坐标,以药物处理天数为横坐标作生长曲线。
1.2.3 统计方法数据以±s表示,采用spss1310软件进行单因素方差分析。
2结果
2.1 mtt法测定的结果mtt法结果显示桔皮素对smmc7721的增殖具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性，72小时的ic50值为14.6921.11μg·ml-1。如表1所示，不同浓度的桔皮素对smmc7721细胞的增殖均有一定程度的抑制作用，同一时间各组与dmso溶剂对照组相比差异具有统计学意义（p<0.05），各dmso溶剂组与同一时间的阴性对照组相比差异无统计学意义。桔皮素浓度为0.24-30μg·ml-1时，对smmc7721细胞在药物处理72小时后抑制率为3.85%-93.59%。表1 不同浓度的桔皮素对细胞增殖的剂量性影响
2.2生长曲线结果不同浓度的桔皮素对smmc7721细胞生长均有一定的抑制作用，与阴性对照组相比，加药组细胞增殖明显减缓，30μg·ml-1浓度组第四天细胞数减少到0,其余两个浓度组在第五天细胞数也都减少为0。阿霉素组对smmc7721细胞增殖有明显的抑制作用，阴性对照组细胞生长良好。如图所示，各加药处理组细胞与阴性对照组相比增殖减缓，且呈明显的量效和时效关系，即随着桔皮素浓度的增大，对smmc7721细胞增殖抑制作用增强，并随桔皮素作用时间的延长，对细胞增殖抑制作用增强。adm对细胞增殖有强的抑制作用，证明实验可靠性好。
图1桔皮素对smmc7721细胞增殖的时间性影响3讨论 本实验为了研究桔皮素对人肝癌smmc7721细胞在体外的作用，采用mtt法及生长曲线法进行检测。mtt实验结果显示，不同浓度的桔皮素对smmc7721细胞的增殖均有不同程度的抑制作用，抑制作用随着桔皮素的浓度增大而增强。同一时间，给药组与dmso溶剂对照组的差异具有统计学意义（p<0.05）。ndst软件的bliss法计算72小时的ic50值为14.69μg·ml-1-21.11μg·ml-1。桔皮素对smmc7721肝癌细胞的抑制作用呈剂量依赖关系。生长曲线绘制后的结果显示，不同浓度的桔皮素对smmc7721细胞的生长均有一定的抑制作用。给药组和阴性对照组相比，细胞生长明显减缓且收到抑制，抑制作用随着时间的延长和给药剂量的增加而增强，呈明显的时效和量效关系。
目前，癌症仍是给人类健康带来致命威胁的几大因素之一。抗癌药物的研究一直都是国内外科学研究的重点之一，而从天然物质中寻找毒副作用小，安全有效的抗肿瘤药物已成为近年来的研究热点。桔皮素和川陈皮素都是从柑橘果实中提取的一种多甲基黄酮类化合物，都具有抗氧化，抗肿瘤侵袭和转移的作用。目前国内对川陈皮素的研究较多，已有研究证明它在体外能抑制人肝癌smmc7721细胞的增殖；在小鼠腋下接种肝癌细胞h22的移植瘤模型中，有一定的抑瘤作用[8]。国内对于桔皮素的研究较少，在兽医学中，关于桔皮素的一种乙酰化衍生物治疗动物螨病的研究比较多[9]。而国外一些文章中报道，桔皮素的抗肿瘤抗氧化作用都明显优于川陈皮素。关于桔皮素的作用机制，有报道认为在人非小细胞癌a549和h1299中，桔皮素通过抑制p38 mapk，jnk,akt的活性而抑制由il1β诱导的cox2的表达[10]。而桔皮素对smmc7721细胞增殖的抑制作用的机制有待进一步探讨。
【参考文献】
1 王再谟，付荣周，唐章全.现代中药临床应用[m].北京：人民卫生出版社，2005：234236.
2方修贵，戚行江，胡安生.柑橘果实中抗癌活性物质的研究现状和前景[j].食品与发酵工业，2003，29（10）：7982.
3satoru kawall, yasuhiko tomono, eriko katase, et al. antiproliferative activity of flavonoids on several cancer cell lines [j]. bioscience, biotechnology & biochemistry. 1999,63(5):896899.
4 管晓琳,朱玲,周黎明. 川陈皮素对非小细胞肺癌a549 细胞的抑制作用[j]. 四川生理科学杂志.2005, 27 (2): 5455.
5morley l, ferguson j, koropatnick j.tangeretin and nobiletin induce g1 cell cycle arrest but not apoptosis in human breast and colon cancer cells [j]. cancer letters.2007，251(1)：168178.
6 bracke me, bruyneel ea, vermeulen sj,et al. citrus flavonoid effect on tumor invasion and metastasis[j].food technol.1994,48(7)：121124.
7 bracke me, depypere ht, boterberg t, et al. influence of tangeretin on tamoxifen's therapeutic benefit in mammary cancer[j]. cancer inst. 1999，91(4)：354359.
8 赵妍妍，马秀英，周黎明.川陈皮素对肝癌细胞的抑制作用[j].华西药学杂志.2007, 22 (2) : 149151.
9 张祚新，吴永魁，祁超等．桔皮素乙酰酯对动物螨病的治疗及安全性试验 [j]．吉林农业大学学报．2002，24（5）：8689.
10 chen k h,weng m s，lin j k. tangeretin suppresses il1βinduced cyclooxygenase (cox)2 expression through inhibition of p38 mapk, jnk, and akt activation in human lung carcinoma cells[j]. biochemical pharmacology 2007,73（2）： 215227.
