系统指纹定量法鉴别龙胆泻肝丸质量
【摘要】 建立龙胆泻肝丸(longdanxiegan pill，ldxgp)的高效液相色谱(hplc)指纹图谱，以系统指纹定量法评价其质量。采用rphplc法，以宏定性相似度为参量对12批ldxgp进行聚类分析，确定用其中10批生成对照指纹图谱(rfp)，以此rfp为标准用系统指纹定量法评价12批ldxgp质量。以龙胆苦苷为参照物峰，确定60个共有指纹峰，建立了ldxgp的hplc指纹图谱。用系统指纹定量法鉴别出8批质量合格，1批含量明显偏高，1批含量明显偏低，2批化学成分数量和分布比例不合格。系统指纹定量法将整体定性分析和整体定量分析密切结合，是评价中药质量的有效方法。
【关键词】 系统指纹定量法，龙胆泻肝丸，高效液相色谱指纹图谱，宏定性相似度，宏定量相似度，相对信息量指数
1 引 言
龙胆泻肝丸(longdanxiegan pill，ldxgp)是由龙胆、柴胡、黄芩、栀子(炒)、泽泻、关木通、车前子(盐炒)、当归(酒炒)、地黄和炙甘草10味药组方，是中医治疗肝胆实火，三焦湿热的重要良药[1]。有文献报道以高效液相色谱(hplc)法测定ldxgp中黄芩苷[2]、龙胆苦苷和栀子苷含量[3]，并以此作为质量控制方法。但中药治疗疾病是依靠其组分之间的协同作用，仅测定几种主要活性成分的含量不能全面反映其质量[4]。Www.11665.coM近年来，指纹图谱技术[4～6]受到广泛的关注，在中药质量控制中发挥着重要作用。在指纹图谱的定性相似度评价中，我国广泛使用夹角余弦法和相关系数法，但这两种方法受大指纹峰影响严重，严重掩盖小峰贡献，并且无定量评价功能，可能导致误判。本研究建立了系统指纹定量法，利用宏定性相似度sm，宏定量相似度pm和均化系数相对偏差α来控制中药质量，克服了上述缺点。实验建立了12个厂家的ldxgphplc指纹图谱，并采用本方法测定其化学成分数量、分布比例和化学成分整体含量差异，为ldxgp质量控制提供新参考。
2 系统指纹定量法原理[7]
从系统观和整体论角度出发，中药质量控制应采取整体定性分析与整体定量分析相结合的方法。指纹图谱是从n维向量空间进行表征和描述的模型方法，系统指纹定量法是在对中药系统指纹整体定性分析基础上，直接对中药系统指纹进行整体定量分析，是对中药系统的整体量化评价，具有真实性和可靠性。中药指纹图谱评价实质是针对样品指纹向量x=(x1,x2,…,xn)和标准指纹图谱的对照指纹向量y=(y1,y2,…,yn两个系统的定性定量差异比较，xi与yi为各指纹峰面积。双定性相似度(定性相似度sf与比率定性相似度s′f)[7]均值sm称为宏定性相似度，见式(1)，能够整体监测中药化学指纹数量和分布比例。当sm满足表1值时，认为中药化学成分数量、分布比例满足相应级要求。根据指纹系统模糊性降低情况，可决定是否进行整体定量鉴别评价。双定量相似度(投影含量相似度c与定量相似度p)[7]均值pm称为宏定量相似度，见式(2)，能够准确监测中药化学指纹整体含量情况。样品向量x和对照指纹向量y与a=(1,1,…，1)的夹角余弦分别为γx和γy[8]，分别代表样品和对照指纹图谱的指纹峰信号均化程度。样品均化系数相对偏差α定义见式(3)，用于限定中药化学指纹比例变异范围。将sm、pm及α结合评价中药质量的方法称为系统指纹定量法，据此将中药质量可划分为8级，见表1。sm=12(sf+s′f)=12∑ni=1xiyi∑ni=1x2i∑ni=1y2i+∑ni=1xiyin∑ni=1xiyi2(1)
pm=12(c+p)=12∑ni=1xiyi∑ni=1y2i+∑ni=1xi∑ni=1yisf×100%(2)
α=1-γxγy=1-pc(3)表1 系统指纹定量法划分中药质量级
table 1 traditional chinese medicine (tcm) quality grades divided by systematic quantified fingerprint method para.ⅰⅱⅲⅳⅴⅵⅶⅷsm≥0.950.90～0.950.85～0.900.80～0.850.70～0.800.60～0.700.50～0.60<0.5pm (%)95～10590～11080～12075～12570～13060～14050～1500～∞ α≤0.050.05～0.100.10～0.150.15～0.200.20～0.300.30～0.400.40～0.50>0.50质量
quality极好
best很好
better好
good良好
fine中
moderate一般
common次
defective劣
inferiorsm：宏定性相似度(macro qualitative similarity); pm：宏定量相似度(macro quantitative similarity);α：均化系统相对偏差(relative deviation of leveling coefficient)。
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
1100型液相色谱仪(配有dad检测器、四元低压梯度泵、在线脱气装置、自动进样器)和chemstation工作站(美国agilent公司);re52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);sarturius2bs110s分析天平(北京赛多利斯天平有限公司);kq50b 型超声波清洗器(昆山市超声仪器公司);kdm 型控温电热套(山东鄄城华鲁仪器公司)。
甲醇与乙腈(色谱纯, 山东禹王实业有限公司禹城化工厂)，冰醋酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心)，95%(v/v)乙醇(分析纯,康科德科技有限公司)。龙胆苦苷、黄芩苷、甘草酸单铵和绿原酸对照品 (中国药品生物制品检定所)。12批ldxgp生产厂家(批号)：s1北京同仁堂制药有限公司(8083023)、s2赤峰天奇制药有限公司(20080121)、s3河北药都药业有限公司(20080112)、s4河南百年康鑫药业有限公司(20071001)、s5石家庄海天药业有限公司(20070901)、s6沈阳中药制药有限公司(071001)、s7哈药集团世一堂制药厂(0710146)、s8白城市多邦药业有限公司(20070302)、s9丹东药业有限公司(071001)、s10药都制药集团有限公司(080106)、s11辽宁金丹药业有限公司(20080111)。s12山东仙河药业有限公司(070802)，购于药店，其中s1～s4为水丸，s5～s11为大蜜丸，s12为浓缩丸。水为去离子水。
3.2 溶液制备
3.2.1 对照品溶液制备 准确称取龙胆苦苷对照品5.0 mg于25 ml容量瓶中, 用甲醇定容，摇匀得200 mg/l的对照品溶液。同法分别配制500 mg/l黄芩苷、甘草酸单铵和绿原酸对照品溶液。
3.2.2 样品供试液制备 取ldxgp(水丸)剪碎，称取8.75 g, 加75%(v/v)乙醇60 ml，回流提取2 h, 过滤, 残渣加75%(v/v)乙醇50 ml继续回流1.5 h, 合并两次滤液, 减压浓缩至约20 ml,水沉淀24 h,过滤，浓缩，再用50%(v/v)乙醇定容至25 ml，摇匀作供试液(s1～s4)。同法制备与水丸原生药材量相当的大蜜丸供试液(s5～s11)和浓缩丸供试液(s12)。3.3 hplc指纹图谱检测条件
century sil c18bds柱(20 cm×4.6 mm, 5 μm);流动相: a为1% hac溶液， b为1% hac乙腈; 线性梯度洗脱： 0～3 min， 0% b; 3～9 min， 0→5% b; 9～22 min， 5%→10% b; 22～30 min， 10%→12.5% b; 30～45 min， 12.5%→18% b; 45～60 min， 18%→30% b; 60～80 min， 30%→60% b; 80～85 min， 60%→75% b。紫外检测波长265 nm, 流速1.0 ml/min, 柱温(30.0±0.15) ℃, 进样量10 μl, 洗脱时间95 min。
4 结果与讨论
4.1 实验条件优化
甲醇超声提取30 min,分别在254、265、280、326和350 nm下检测;以水、25%乙醇、 50%乙醇、75%表2 甲醇为提取剂不同检测波长的ldxgp色谱指纹图谱相对信息量指数ir
wavelength (nm)254265280326350ir11.211.311.210.510.4乙醇和95%乙醇为溶剂提取样品，前三者以80%乙醇沉淀24 h，后二者以水沉24 h，分别记录色谱图。以色谱指纹图谱相对信息量指数ir[9]为优化目标函数,其综合指纹峰信号强度、信号分布均匀性、信息量和分离效率以及制剂取量q(mg)等信息，越大越好，ir结果见表2和表3。虽然以25%乙醇和75%乙醇为提取剂时ir值相等，但以25%乙醇提取时峰数较少，故选择75%乙醇为提取剂，检测波长为265 nm。表3 不同提取剂的ldxgp色谱指纹图谱相对信息量指数ir
4.2 系统适用性实验
准确吸取绿原酸(cga)、龙胆苦苷(gps)、黄芩苷(bcl)和甘草酸(ghia)对照品溶液和样品供试液各10 μl，分别进样，记录色谱图见图1;对比保留时间及在线紫外光谱图可知，图1中14号、17号、33号和49号峰分别为绿原酸、龙胆苦苷、黄芩苷和甘草酸。因gps峰与相邻峰分离良好且稳定，因此选gps作参照物峰。在本实验条件下，测得其理论板数应不低于160000。测定2 h空针和供试液2 h色谱图，在83 min附近出现小的溶剂干扰峰,应排除其为指纹峰, 确定洗脱时间为95 min。
4.3 精密度、稳定性及重复性实验
准确吸取s3号供试液10 μl，连续进样6次，记录色谱图。以龙胆苦苷的保留时间和峰面积为参照，计算各指纹峰相对保留时间rsd<1.0%，各指纹峰相对峰面积rsd<3.0%。表明本系统进样精密度良好。
精密吸取s3号供试液,分别在制备样品后0、4、7、11及14 h进样10 μl,记录色谱图。以龙胆苦苷的保留时间和峰面积为参照，计算各指纹峰相对保留时间rsd<1.0%, 相对峰面积rsd<3.0%, 表明样品在14 h内稳定。
取s3号样品制备供试液5份，吸取10 μl进样测定，记录色谱图。以龙胆苦苷的保留时间和峰面积为参照，计算各指纹峰相对保留时间rsd<1.0%, 相对峰面积rsd<3.0%,表明方法重复性良好。
4.4 ldxgp指纹图谱建立
将12个厂家的ldxgp供试液分别进样检测，记录色谱图。以龙胆苦苷(17号)为参照物峰，峰出现率按100%计，确定60个共有指纹峰。将积分信号导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0”软件[10]，以平均值法计算生成准对照指纹图谱(prfp)，并计算12批样品宏定性相似度。以sm为指标将12批样品进行聚类分析，结果s2～s11为第ⅰ类，s1和s12为第ⅱ类。因第ⅰ类样品的sm>0.85，表明其化学成分种类和分布比例很相似，故选第ⅰ类样品按平均值法计算生成对照指纹图谱(rfp)。以此rfp为评价标准计算12批样品的sm和pm及α值见表4。表4 系统指纹定量法评价12批ldxgp质量的结果
4.5 整体评价ldxgp质量
若规定sm≥0.88定性相似度合格，则s2～s11均为合格品，这说明样品的化学成分数量和分布比例十分相似， 图2 12批ldxgp的α， sm 和pm的3d图
fig.2 3d graph of α, sm and pm values of 12 batches of ldxgps而s1和s12为不合格品。若含量相似度合格标准为75%≤pm <125%(α≤0.15)， 从表4得出，s4含量低，s7含量高，这两个厂家的ldxgp质量虽然在化学成分分布上与对照指纹图谱十分相似，但因含量超限都属于不合格品。可见，中药的质量评价仅以定性相似度为标准是不合理的，会导致误判。其余8批完全合格，s6最为理想，其次是s8和s9，再次是s2、s3、s5、s10和s11。质量呈4类分布(见图2)。按照系统指纹定量法(表1)规定对12批样品进行质量划级(见表4)。
本研究以ir为目标函数对色谱条件进行优化选择，以龙胆苦苷峰为参照物峰，建立了ldxgphplc指纹图谱。系统指纹定量法是在对中药系统指纹整体定性分析基础上，直接对中药系统指纹进行整体定量鉴别，是对中药质量整体量化评价的可靠方法。本研究可为现代中药质量控制提供有益的参考。
【参考文献】
1 editorial committee of the pharmacopoeia of republic of china (中华人民共和国卫生部药典委员会). the pharmacopoeia of the people′s republic of china, part 1.(中华人民共和国药典(一部) ). beijing (北京)： chemical industry press (化学工业出版社), 2005: 461
2 li chuyun(李楚云), lan hongmei(蓝红梅), yuan xuewen(袁学文). guangdong pharmacy.(广东药学), 2004, 14(6)： 21～22
3 liu ruixin(刘瑞新). chin tradit pat med(中成药), 2007, 29(8)： 1170～1172
4 hu kun(胡 坤), zhao shulin(赵书林). chinese j. anal. chem.(分析化学), 2007, 35(6)： 857～860
5 wang yiqi(王一奇), ma yuanyuan(马源源), wu yan(吴 雁), zhang yuefei(张跃飞), li famei(李发美). chinese j. anal. chem.(分析化学), 2006, 34(12)： 1791～1793
6 shao qing(邵 青), cheng yiyu(程翼宇). chinese j. anal. chem.(分析化学), 2006, 34(6)： 863～866
7 sun guoxiang(孙国祥), ren peipei(任培培), bi yumeng(毕雨萌), bi kaishun(毕开顺), sun yuqing(孙毓庆). chinese journal of chromatography(色谱), 2007, 25(4)： 518～523
8 sun guoxiang(孙国祥), hou zhifei(侯志飞), zhang chunling(张春玲), bi kaishun(毕开顺), sun yuqing(孙毓庆). acta pharmaceutica sinica(药学学报), 2007, (1)： 75～80
9 sun guoxiang(孙国祥), hou zhifei(侯志飞), bi yumeng(毕雨萌), bi kaishun(毕开顺), sun yuqing(孙毓庆). acta pharmaceutica sinica(药学学报), 2006, 41： 857～862
10 sun guoxiang(孙国祥), zhi xuezhi(智雪枝), zhang chunling(张春玲), dong hongye(董鸿晔). central south pharmacy(中南药学), 2007, 5(6)： 549～555
