【摘要】 目的 观察出生后早期有限次数速灭威染毒对icr小鼠青春期和成年早期神经行为和空间学习记忆能力的影响以及自主活动能力、感觉运动能力和焦虑情绪是否影响空间学习记忆能力，并探明其影响的发生时间。方法 小鼠出生后随机分为5组，即速灭威高、中、低剂量组(5 mg/kg、0.5 mg/kg、0.05 mg/kg,)，溶剂对照组(dmso)和生理盐水对照组(ns)，于出生后第3、5、7、9、11、13天进行腹腔注射染毒。观察一般生理发育情况，并选用成组的神经行为学实验在青春期(～pnd60)和成年早期(～pnd90)进行测试。结果青春期小鼠平衡木得分与染毒剂量呈负相关关系(rs=-0.418，p<0.05);青春期和成年早期的洞板实验和旷场实验中各指标在同期各组间均无统计学意义;青春期morris水迷宫空间探索实验中，定位航行结束后和次日的两次穿越平台位置次数与染毒剂量之间均呈负相关关系(rs分别为-0.361和-0.277，p<0.05);成年早期morris水迷宫空间探索实验中，第四象限时间百分比与染毒剂量之间呈负相关关系(rs=-0.390，p<0.05);主成分分析发现，反映空间学习记忆能力与自主活动能力、感觉运动能力及焦虑情绪的指标出现在不同的主成分中。结论 出生后早期有限次数接触速灭威可能在青春期时已经开始影响到小鼠的空间记忆能力，这可能是成年后空间学习记忆能力损害的重要线索。
【关键词】 小鼠; 神经行为学表现; morris水迷宫; 主成分分析
effects of early postnatal exposure to mtolyl methylcarbamate on spatial learning and memory ability of mice zhang qian, wang qunan, xia yubao, wang zhigang, zhang qingdong. department of toxicology, anhui medical university, hefei 230032, china
【abstract】 objective to observe the effects of early postnatal exposure to lowdose mtolyl methylcarbamate (mtmc) on neurobehavior and spatial learning and memory ability in adolescent and early adult mice, and to dertermine when to affect this ability. methods icr mice pups randomly divided into 5 groups received intraperitoneal injections (i.p.) of different doses of mtmc (5 mg·kg-1,0.5 mg·kg-1,0.05 mg·kg-1), dmso solution and normal saline respectively every other day during postnatal days (pnd) 3～13. the general physiological condition and neural development of mice during experiment were evaluated, and a battery of tasks, i.e. holeboard test, beam walking, open field, morris water maze (mwm), was used to assess their neurobehavior and spatial learning and memory ability in different time. results scores were negatively correlated to the doses of mtmc by spearman rank correlation analysis in beam walking on pnd60 (rs=-0.418，p<0.05). there were no significant differences among all groups in holeboard test and open field. numbers of platformsite crossovers in probe phases of mwm procedure immediately after learning phases and next day about on pnd60 were negatively correlated to the doses of mtmc by spearman rank correlation analysis (rs=-0.361 and -0.277，p<0.05). time in the target quadrant in probe phases of mwm procedure about on pnd90 were negatively correlated to the doses of mtmc by spearman rank correlation analysis (rs=-0.390，p<0.05). noteworthy, principal components analysis showed that spatial learning and memory performance may not be related to performance in any of the three sensorimotor tasks. conclusions postnatal early exposure to mtmc may affect spatial memory ability at least in adolescent mice, which would be the critical cues for the damage of spatial memory ability in adult mice.
【key words】mice; neurobehavioral manifestations; morris water maze; principal components analysis
氨基甲酸酯类农药是继有机氯、有机磷类农药之后发展起来的一种高效、广谱型杀虫剂，农业上广为应用，它们与有机磷类农药一样，能够抑制神经末梢乙酰胆碱酯酶(ache)的活性[1]，从而影响神经传导。wWW.11665.cOM以往的研究显示接触氨基甲酸酯类农药有一定的发育毒性[2,3]，但是对于慢性接触后的神经发育毒性尤其是对神经行为方面影响的研究甚少。速灭威(mtolyl methylcarbamate,mtmc)是目前我国最常用的氨基甲酸酯类农药之一，本小组以前的研究显示[4]出生后早期有限次数接触速灭威对小鼠成年后的空间记忆能力有一定损伤，但损伤发生的时间尚不明确。本次研究选用成组的神经行为学实验，观察出生后早期接触速灭威对小鼠青春期和成年早期神经行为以及空间学习记忆能力的影响，以期探明其发生早期影响的时间。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器 速灭威(纯度99.8%)、二甲基亚砜(dmso)、硫代乙酰胆碱(asch)、5,5-二硫二硝基苯甲酸(dtnb)均购自sigma公司，洞板实验装置和morris水迷宫装置及程序均购自中国药物研究所。
1.2 实验动物及处理 清洁级icr小鼠(8～10周，♂30～32 g，♀26～28 g)购自安徽省动物中心。实验前适应性喂养1周，按2∶4(♂∶♀)于pm 9:00合笼，次日am 7:00检查阴栓。仔鼠出生后(postnatal day，pnd)，每窝仔鼠调整为10只，同时将每窝小鼠随机分为5组：速灭威高、中、低剂量组(5 mg/kg、0.5 mg/kg、0.05 mg/kg)，溶剂对照组(dmso)和生理盐水对照组(ns)。每个剂量组内尽量保持雌雄各半。小鼠出生当天定为出生后第0天(pnd0)，然后于pnd3、5、7、9、11、13 定时进行腹腔注射染毒，染毒体积为每克体重2 μl，要求注射部位无炎症表现。待仔鼠断乳(pnd21)后，雌雄分笼饲养，每笼4～5只，自由饮水饮食。专人定时监测仔鼠体重，观察其生长发育情况，并进行神经行为学实验。实验期限为pnd0～pnd98。
1.3 行为学实验 包括青春期(～pnd60)和成年早期(～pnd90)两次行为学测试。
1.3.1 洞板实验 在50 cm×50 cm平板上有16个直径3.0 cm的小孔，将小鼠置于板中央，电脑程序自动记录90 s内小鼠的探洞次数。
1.3.2 平衡木实验 在直径120 cm的铁水盆上(内盛有水)放置一根直径1 cm的金属杆，两端设有平台，并固定于水盆边缘。将小鼠放于金属杆中央，观察60 s，视小鼠在杆上移动的距离评分：60 s内从杆上落入水中记为0分;自中央到两侧±15 cm内移动记为1分;自中央到两侧±30 cm内移动记为2分;自中央到两侧±60 cm内移动记为3分;到达两端任意平台者记为4分。每只小鼠测试3次，取其平均得分。
1.3.3 旷场实验 参照文献[5]描述，设计一个旷场程序来测定小鼠的自主探索运动活性和焦虑性。将小鼠置于旷场箱内，让其自由探索3 min，记录小鼠跨越的潜伏期、跨越格子数、站立次数、排便颗粒数以及捋毛次数。每次实验前75%乙醇清除前只仔鼠气味，擦拭干净，乙醇挥发完全后进行下一只动物测试。
1.3.4 morris水迷宫实验 检测小鼠空间学习记忆能力，包括定位航行实验和空间探索实验两部分[6,7]。本水迷宫为一直径120 cm，高50 cm圆形水池，等分为ⅰ、ⅱ、ⅲ及ⅳ象限，在ⅳ象限中间距边缘25 cm放一低于水面1 cm的平台。迷宫上方安置摄像机，用中国药物研究所研制的morris水迷宫程序采集实验数据。训练期间迷宫外参照物不变，水温恒定(21±1)℃，定位航行共进行6 d，每天训练4次，每次小鼠于池边4个固定点面向池壁入水，允许寻找90 s，找到后在平台上保持15 s，如找不到，则引导到平台上保持15 s，每天入水顺序随机改变，记录小鼠登台潜伏期。最后一天定位航行结束后(d6)和次日(d7)进行空间探索实验：撤去平台，小鼠在第ⅱ象限入水点，其余条件不变。记录小鼠入水后60 s内在各象限区的游泳时间和穿越平台位置次数。
1.4 统计方法 文中结果均以±s表示。对于morris定位航行实验的登台潜伏期，采用两因素(性别与剂量组)重复测量方差分析[8]，其余资料均采用两因素方差分析。由于染毒剂量资料不符合正态分布，故两变量间的相关分析采用spearman秩相关。为了分析各实验指标之间的关系，采用主成分分析。由于定位航行实验中登台潜伏期在前3 d下降很快，故分别用前3 d和后3 d的平均潜伏期作为变量进入主成分分析。检验水准设为0.05，所有统计分析均在spss 13.0软件中进行。
2 结果
2.1 mtmc对小鼠体重的影响 小鼠出生后各时点体重在各剂量组之间和性别之间无统计学差异(p>0.05)。
2.2 mtmc对小鼠神经行为的影响
2.2.1 洞板实验 pnd60和pnd90各剂量组之间和性别之间均没有统计学差异(p>0.05)，其中pnd60时探洞次数见表1。
2.2.2 平衡木实验 pnd60时各剂量组之间和性别之间没有统计学差异(p>0.05)，spearman等级相关分析显示，平衡木得分与染毒剂量之间呈负相关关系(rs=-0.418，p<0.05)，见表1。至pnd90时，雌雄各剂量组之间和性别之间均无统计学差异。 表1 各剂量组pnd60洞板实验和平衡木实验结果
2.2.3 旷场实验 其中潜伏期和跨越格子数反映自主活动能力，站立次数、排便颗粒数和捋毛次数则反映焦虑情绪。pnd60和pnd90时各指标在剂量组之间和性别之间没有统计学差异(p>0.05)。但小鼠跨越格子数在pnd60时明显高于在pnd90时(p<0.05)，见表2。表2 pnd60和pnd90时各剂量组旷场实验中跨越格子数比较note: *p<0.05 vs mean of pnd60
2.3 mtmc对小鼠空间学习记忆能力的影响
2.3.1 morris定位航行实验 随着训练天数的增加，各组小鼠登台潜伏期逐渐缩短，且每个剂量组内各训练日之间有统计学差异(p<0.01)，表明各组小鼠经多次学习训练后均已学会寻找平台;但每个训练日时的剂量组之间无统计学差异，说明出生后有限次数mtmc染毒对成年后小鼠的空间学习记忆能力未造成影响，见图1。至pnd90时，各剂量组小鼠在各时点的潜伏期均有所下降，这可能是由于小鼠存在一定参考记忆而引起的。
2.3.2 morris空间探索实验 比较各组小鼠的空间游泳轨迹图(图2)可以看出：对照组小鼠的运动轨迹多集中于第ⅳ象限;染毒组小鼠的运动轨迹则随机分布于各个象限，且剂量越高，轨迹的边缘化越明显。青春期和成年早期空间探索实验的第iv象限时间百分比和穿越平台位置次数在各剂量组之间和性别之间均没有统计学差异(p>0.05)。青春期spearman等级相关分析显示，d6和d7时的穿越平台位置次数与染毒剂量之间均呈负相关关系，且两相关系数之间无统计学差异(p>0.05)，说明mtmc染毒对小鼠的工作记忆和参考记忆均有一定影响。至成年早期时，spearman等级相关分析显示，d7时的第iv象限时间百分比与染毒剂量之间呈负相关关系，说明mtmc染毒对小鼠成年早期的空间记忆能力也有一定影响。结果见表3、4。
2.4 pnd60小鼠神经行为学指标的主成分分析 检验变量间偏相关性的kmo统计量为0.651表3 各剂量组pnd60时morris空间探索实验结果表4 各剂量组pnd90时morris空间探索实验结果note: *a mouse was lost in ns control(>0.5)，且球形检验中p值小于0.001，说明选择的变量适合主成分分析。本分析根据特征根的大小提取出5个主成分(因子)，见表5。morris水迷宫定位航行和空间探索实验中各变量主要贡献于第一主成分，而且它们的因子负荷值相反。洞板实验中的探洞次数和平衡木实验中的得分分别进入第三、五主成分;旷场实验中潜伏期、跨越格子数、站立次数和捋毛次数对第二主成分有贡献，其中潜伏期和其他指标是以相反的因子负荷进入的，而排便颗粒数则对第四主成分有主要贡献。表5 pnd60小鼠神经行为学实验的主成分分析note: *the rotated method used was varimax with kaiser normalization, loading less than 0.20 were omitted. aloading higher than 0.5
3 讨论
本研究从小鼠出生后到断乳，直至青春期(～pnd60)和成年早期(～pnd90)，动态观察了出生后早期接触mtmc对小鼠神经行为，特别是空间学习记忆能力的影响。mtmc染毒对出生后小鼠体重没有影响。在青春期的平衡木实验中，虽然各染毒组与对照组比较，在得分上未显示有统计学差异，但染毒剂量与得分之间有呈现出负相关，提示染毒对小鼠的感觉运动能力有一定影响。在旷场实验中，尽管在青春期和成年早期各指标在性别和剂量组之间均未发现有统计学差异，但是反映自主活动能力的跨越格子数在pnd60时明显高于pnd90时，提示年龄因素可能对染毒小鼠的神经行为有一定影响。
morris水迷宫定位航行实验是评估啮齿类动物空间学习能力的经典程序。在青春期，随着训练天数的增加，各组小鼠的登台潜伏期逐渐缩短，表明各组小鼠都具有通过学习找到平台的能力;但各剂量组之间直至成年早期(～pnd90)时均无统计学差异。结合以前的研究[4]，到pnd120时各时点登台潜伏期在组间仍无统计学差异。这说明出生后早期接触mtmc对小鼠至少到成年期(～pnd120)的空间学习能力尚未造成影响。
morris水迷宫空间探索实验可以评价啮齿类动物空间记忆能力，其中定位航行结束后(d6)的空间探索主要反映其工作记忆或试验依赖性记忆，而结束后次日(d7)的空间探索主要反映其参考记忆[7]。在青春期空间探索实验中，随着剂量的升高，小鼠在d6和d7时的穿越平台位置次数均有减少的趋势。到成年早期时，d7时的目标象限(ⅳ象限)时间百分比随染毒剂量升高也呈下降趋势。直到成年期(～pnd120)时，在目标象限游泳时间百分比和穿越平台位置次数显现出统计学差异[4]。这提示出生后早期接触mtmc导致的小鼠成年后空间记忆能力损害的进展过程较为隐匿，但在青春期(～pnd60)已经开始出现线索，即表现出了其工作记忆和/或参考记忆能力的下降趋势。
主成分分析(因子分析)以往被应用于区分老年鼠不同学习记忆实验测量因子的研究[9]。近来，chen等[10]又将其应用到区分不同学习记忆实验和基于感觉运动及焦虑实验的测量因子研究中。本研究中显示，morris定位航行实验中登台潜伏期与空间探索实验中各指标以相反的因子负荷同时进入第一主成分，且解释了总变异的27.43%;反映自主活动能力的探洞次数与反映感觉运动能力的平衡木得分分别出现在第三、五主成分中，旷场实验中反映自主活动能力的潜伏期和跨越格子数以相反的因子负荷出现在第二主成分中，这提示洞板实验和旷场实验可能检测了自主活动能力的不同方面。同样，反映焦虑情绪的站立次数、捋毛次数与排便颗粒数分别出现在第二与四主成分中，可能也是焦虑情绪在不同方面的表现。这提示出生后早期有限次数接触mtmc后的小鼠空间学习记忆能力可能不受其自主活动能力和感觉运动能力以及焦虑情绪的影响。
综上所述，出生后早期有限次数接触速灭威导致小鼠成年后空间记忆能力损害，在青春期时已经开始出现工作记忆和/或参考记忆能力下降的信号。
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